Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury
Summary
Wir stellen eine in-Vivo imaging-Verfahren unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, um dynamische Wirbelsäule Gefäßveränderungen nach contusive Rückenmarksverletzungen bei Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten zu verfolgen.
Abstract
Verletzungen des Rückenmarks (SCI) verursacht erhebliche vaskuläre Störungen auf dem Gelände der Verletzung. Vaskuläre Pathologie tritt unmittelbar nach dem SCI und setzt sich während der Phase der akuten Verletzung. In der Tat erscheinen Endothelzellen, die erste zu sterben nach einer contusive Sci. Die frühen vaskuläre Ereignisse, einschließlich erhöhten Durchlässigkeit der Blut-Rückenmark-Schranke (BSCB), induzieren Vasogenic Ödem und dazu beitragen, schädliche sekundäre Verletzungen Ereignisse durch komplexe Verletzungen Mechanismen verursacht. Ausrichtung auf die vaskuläre Störung könnte daher eine Schlüsselstrategie, sekundäre Verletzungen Kaskaden zu reduzieren, die dazu, histologische und funktionelle Beeinträchtigungen nach Sci beitragen. Frühere Studien wurden meist an Post-mortem Proben durchgeführt und waren nicht in der Lage, die dynamischen Veränderungen des vaskulären Netzwerks zu erfassen. In dieser Studie entwickelten wir ein in Vivo Duo-Farbe zwei-Photon bildgebendes Verfahren zur Überwachung der akuten dynamische Gefäßveränderungen nach contusive Sci. Dieser Ansatz ermöglicht die Erkennung von Blutfluss, Schiffs Durchmesser und anderen vaskulären Erkrankungen an verschiedenen Standorten der gleichen Ratte vor und nach der Verletzung. Insgesamt stellt diese Methode einen ausgezeichneten Ort für die Untersuchung von vaskulären Dynamik.
Introduction
Traumatischer Querschnittlähmung (SCI) ist eine häufige Verletzung führt zu einer Beeinträchtigung der motorischen, sensorischen und autonome Funktion. Nach der nationalen Rückenmark Verletzungen statistischer Center (NSCISC) im Jahr 2016, ca. 282.000 Personen betroffen waren, während 69 % von ihnen vor allem aufgrund von Verkehrsunfällen waren oder1fällt. Diese Patienten benötigen häufig Intensive Pflege; keine wirksame Behandlung ist jedoch derzeit verfügbar. Neue Strategien in Richtung SCI sind daher dringend erforderlich.
SCI ist hauptsächlich in zwei Phasen unterteilt: Verletzungen primäre und sekundäre Verletzungen. Die primäre Schädigung umfasst die körperliche Beleidigung verursacht hämorrhagische Nekrose am Ort der Wirkung2, gefolgt von einer Reihe von sekundären Verletzungen Veranstaltungen wie Entzündung, Apoptose der Zelle und Demyelinisierung der verbleibenden Axone, die schrittweise führen für den Ausbau der morphologischen und funktionellen Defizite3,4,5,6. Blutung ist das ersten sichtbaren Zeichen der Verletzung, zeigt eine sofortige vaskuläre Störungen in der akuten Phase der SCI7,8. Eine neuroprotektive Strategie zur Verringerung der frühen vaskulären Schäden könnten Patienten Erholung verbessern, aber dies erfordert ein besseres Verständnis der pathophysiologischen Mechanismus der frühen posttraumatischen vaskuläre Ereignisse.
Trotz der früheren Studien mit verschiedenen Methoden, um Rückenmark Gefäßsystem zu studieren bleiben erhebliche Einschränkungen. Die meisten gemeinsame Nachteil studiert nur Post-mortem Muster, z. B. Wasserstoff Abstand9, Autoradiographie10, Microangiogram8, vaskuläre Korrosion wirft11und Immunohistochemistry12 ,13. Obwohl Laser Doppler Flowmetry nicht-invasive Echtzeit-Überwachung von Rückenmark Blut fließen14 bietet, ist es nicht in der Lage zu differenzieren zwischen Gefäßsysteme und morphologische Gefäßveränderungen zu erkennen. Dynamische Kontrast-verstärkte MRI (DCE-MRT) ist auch nicht-invasive, aber es erzeugt Bilder mit niedriger Auflösung und erfordert eine teure Infrastruktur15.
Obwohl in Vivo imaging mit 2-Photonen-laser-scanning-Mikroskopie (2P-LSM) entwickelt wurde, für das Studium der Vasodynamics in der Hirnrinde16,17,18, eine begrenzte Anzahl von Studien haben nachgewiesene Gefäßveränderungen nach einem Sci Tang Et Al. haben Änderungen Blutflusses am Rand der Läsion Website in einer Hemisektion Modell19, sondern Bildgebung angezeigt, nachdem eine contusive Verletzung ist schwieriger, aus zwei Gründen. Erstens würde eine herkömmliche optische Glasfenster über Verletzung Aufstellungsort nicht unterstützen die mechanische Wirkung und bleiben funktionsfähig für die Bildgebung. Zweitens, das Austreten von Tracer in das Parenchym wegen Blutung schafft Schwierigkeiten mit posttraumatischen Bildgebung.
Hier präsentieren wir ein neuartige Duo-Farbe bildgebende Verfahren, wodurch imaging der gleichen einzelner Schiffe zu Zeitpunkten vor und nach der Verletzung. Darüber hinaus bietet es eine zeitlich-räumlichen Profil der vaskulären dynamischen Veränderungen, die nach einem contusive Sci. Es hat auch das Potenzial für die Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten nach der Verletzung. Dieses Protokoll kann transgene Tiere, neurovaskuläre Interaktion zu studieren direkt zugewiesen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Herausforderung für vaskuläre Studien nach SCI ist die technische Einschränkung, weil traditionelle Techniken weitgehend auf vaskuläre Strukturänderungen in Post-mortem Proben beschränkt sind. Dieses neuartige in Vivo imaging oben beschriebene Methode ermöglicht dynamische Messung von Blutfluss und die zugehörigen Parameter (Geschwindigkeit und Schiffs Durchmesser) mit 2 P-LSM in live Ratten. Es kann auch wiederholte Prüfung in den gleichen Sets von Schiffen zu verschiedenen Zeitpunkten nach contusive Sci. Vorherigen 2-Photonen-Mikroskopie bildgebende Verfahren konnten posttraumatischen vaskuläre Strukturen durch das Auslaufen von einem einzigen Tracer zu erfassen. Unser Duo-Color-Design ermöglicht dynamische vaskuläre Bildgebung für traumatische Modelle. Darüber hinaus bietet die Flexibilität dieser Methode die Möglichkeit, eine zeitlich-räumlichen Profil der akuten vaskulären Veränderungen nach Sci generieren
In unserem di Vivo Duo-Farbe bildgebende Verfahren gibt es mehrere wichtige Schritte. Erstens ist es grundlegend, die physikalische Stabilität des Rückenmarks vor Zeitraffer Bildgebung, insbesondere Verringerung der Atmung Bewegung Artefakt zu gewährleisten. Wir entwarfen die Form der Wirbelsäule Klammern die Höhe der Wirbelsäule Wirbel während Stabilisierung leicht anheben. So kann die Bewegung des Rückenmarks korrelieren die Atmung Tier sein stark reduziert (Abbildung 1-F, 2 b). Es empfiehlt sich, die Stabilität des Rückenmarks vor Beginn jeder bildgebenden Sitzung zu überprüfen. Wenn das Rückenmark nicht Stabilität zu erreichen, sollte die Ausrichtung und Dichtigkeit des Rückenmarks Klemmen berichtigt werden. Zweite, periphere Gewebe (Knochen, Muskulatur und Haut) Blutungen in der bildgebenden Fenster Kontamination der Ansicht riskieren konnte. Für eine reibungslose bildgebenden Sitzung sollte Gelfoam und Gewebe Klebstoff Leim auf das umliegende Gewebe für eine effektive Prävention angewendet werden. Drittens haben Fluoreszenzfarbstoffen wählen wir eine ähnliche Größe wie Albumin (66 kDa), die die wichtigsten hochmolekularen Blutplasma Protein ist. Homöostatische Bedingungen wurden die Farbstoffe im Innern des Behälters ähnlich wie Albumin28weitgehend beibehalten. Nach der Verletzung die Farbstoffe durch die gestörten Endothelfunktion Struktur übergeben und in das Parenchym, verursacht eine deutliche erhöhte fluoreszente Intensität im peripheren Bereich des Gefäßsystems (Abbildung 3F-g) ausgelaufen. Darüber hinaus gibt es zwei Gründe, warum wir äußere Halsschlagader Katheterisierung. Geben Sie zuerst es konsequent zugängliche Route der Lieferung zu jeder Zeit des Experiments. Zweitens kann es als eine Route für die zukünftige Behandlung Injektion verwendet werden.
Obwohl unsere in-Vivo -Duo-Farbe-Methode einen neuartigen Treffpunkt für traumatische vaskulären bildgebenden bieten kann, müssen einige Vorsichtsmaßnahmen bezüglich dieser Technik angesprochen werden. Derzeit, diese Technik soll Gefäßveränderungen zu 2 Zeitpunkten (Grundlinie und 1 nach der Verletzung Zeitpunkt), aber es ist möglich, zu mehreren Zeitpunkten wechseln, wenn zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffen und Kanäle zur Verfügung stehen. Zwar gibt es mehrere Studien mit implantierten Glasfenster für chronische intravitalen Bildgebung, kann keiner von ihnen Basisinformationen auf dem gleichen Schiff nach traumatischen Verletzungen19,29,30bieten, 31,32. Im Gegensatz zu diesen Studien ist unser Fenster ein keine-Glasfenster. Dies ist praktisch für Pre- und Post-Verletzung Bildgebung, aber es kann eine Herausforderung für die Wiederherstellung des Fensters zur Dauerbeobachtung sein. Unsere zukünftige Forschung arbeitet an der technischen Verbesserung für chronische Belichtung. Das Kreislaufsystem besteht aus verschiedenen Schiffstypen (Arterie, Vene und Kapillare) und jeder ist anders in Aspekte der Morphologie und Funktion. Differenzierung zwischen Schiffstypen während der Bildgebung könnte dazu beitragen, ein klares Muster der vaskulären Veränderungen herauskitzeln. Das obige Protokoll hängt davon ab, auf den Betrachter, die Identifizierung der Schiffe, die anhand der Morphologie und Geschwindigkeit; Allerdings kann eine Arterie-spezifischen Farbstoff einfach hinzugefügt werden, eine genauere Klassifizierung zwischen Schiff Arten33geben.
Diese Technik ist nicht nur beschränkt auf Bewertungen auf contusive und anderen traumatischen Modelle wie Quetschverletzung und Strahlung Verletzungen, aber auch auf Studien mit Schwerpunkt auf Störungen des BSCB, sowie vaskulären Permeabilität ändert. Neben SCI es ließe sich die vaskulären Veränderungen nach anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Multiple Sklerose (MS) zu studieren. Darüber hinaus könnte es übertragbar auf einem transgenen Tiermodell, die dynamische neurovaskuläre Interaktion zu studieren. Als leistungsfähiges Screening-Instrument könnten zukünftige Studien der bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung von Verletzungen des Rückenmarks hier beschriebenen nutzen.
Abschließend dient in Vivo Duo-Farbe-Methode zuverlässig, in Echtzeit und in Vivo Ansatz für die Bewertung von dynamischen Gefäßveränderungen, ist ideal für die Charakterisierung der zeitlich-räumlichen vaskulären Profil und screening für Behandlungen reduzieren Sie Folgeschäden nach Sci.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von NIH NS059622, Merit Review Award I01 BX002356 vom US-Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Stiftung 296749, Indiana Rückenmark und Gehirn Verletzungen Research Foundation (NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 ISCBIRF) der Indiana State Department of Health (019919) und Mari Hulman George Stiftungsfonds.
Materials
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| 1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
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