Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida
Summary
Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.
Abstract
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y la proteína de unión a ácidos grasos adiposa. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados, que podría desempeñar un papel crítico en la regulación de sus funciones inmunes. Numerosos estudios han demostrado que diversos ácidos grasos, saturados o insaturados, poseen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la función. Sin embargo, varían los enfoques utilizados para la preparación de ácido graso que puede conducir a resultados no fisiológicos. Albúmina sérica, un portador natural de ácidos grasos en sangre periférica de mamífero, se recomienda para la formación de un conjugado complejo con la sal de sodio de los ácidos grasos para estudiar la función del ácido graso en células de mamífero, minimizando la toxicidad del jabón de ácido graso. Así, una sencilla, relativamente rápida de la calefacción y sonicando método es desarrollada y presentada aquí para la formación del conjugado ácida grasos BSA. Se describe un protocolo de uso de ácidos grasos saturados, especialmente el esteárico ácidos para inducir muerte celular severa en macrófagos derivado de médula ósea de ratón. Demostramos más que la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados está positivamente asociada con los niveles de ceramida celulares acumulados. Este método se puede extender para los estudios del impacto de los ácidos grasos en las células de otros mamíferos.
Introduction
Los ácidos grasos juegan un papel crítico en el metabolismo energético y en la síntesis de fosfolípidos de membrana en diferentes tipos de células. Los ácidos grasos tienen una solubilidad acuosa baja. Preparación apropiada de ácidos grasos es de vital importancia para el estudio de las funciones biológicas de los ácidos grasos en las células mamíferas. Cuando los ácidos grasos se preparan con etanol, muchos ácidos grasos pueden mostrar su efecto tóxico jabón (detergente) en la membrana celular, incluso en concentraciones relativamente bajas de1. Como un natural, importante transportador de ácidos grasos libres en el suero, la albúmina sérica se considera un buen portador para ácido graso entrega en vitro para ácidos grasos función ensayos2,3,4. Sin embargo, los detalles de la preparación de ácidos grasos y albúmina de suero conjugado generalmente no están disponibles aunque se han publicado numerosos trabajos de investigación utilizando ácidos grasos.
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y adiposo proteína de unión a ácidos grasos5,6,de7,8. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados que puede regular sus funciones inmunitarias. Para estudiar el impacto de los ácidos grasos en los macrófagos y otras células, diferentes métodos de preparación de ácidos grasos fueron aplicados1,7,9. Utilizando apropiadamente preparado, suero, ácidos grasos conjugados de albúmina para investigar el impacto de los ácidos grasos sobre la función de macrófagos es de vital importancia en la obtención de datos biológicamente significativos. Estudios sobre el impacto de los ácidos grasos sobre la función del macrófago pueden proporcionar conocimientos básicos y potenciales dianas terapéuticas relacionadas con el metabolismo de ácidos grasos en enfermedades implicadas macrófagos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación adecuada de solución de ácido graso es de vital importancia para el estudio de la función biológica de los ácidos grasos. La neutralización de los ácidos grasos aumenta su solubilidad en la solución acuosa. Sin embargo, sales de sodio de ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos saturados, son todavía de baja solubilidad en agua o PBS como observado. Un método es utilizar el etanol del 95-100% para ayudar a disolver ácidos grasos1. Usando este método, mayor toxic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado parcialmente por los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) concede a R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
Riferimenti
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