Synthese en evaluatie van een Ruthenium gebaseerde mitochondriale Calcium opname Inhibitor
Summary
Een protocol voor de synthese, zuivering en karakterisering van een ruthenium gebaseerde remmer van mitochondriale calcium opname wordt gepresenteerd. Een procedure voor de evaluatie van de werkzaamheid bij zoogdiercellen permeabel is aangetoond.
Abstract
We detail de synthese en de zuivering van een mitochondriale calcium opname inhibitor, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +. De geoptimaliseerde synthese van dit samengestelde begint uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in ongeopende verpakking, een groene oplossing oplevert. Zuivering wordt bereikt met catie-uitwisseling chromatografie. Deze compound is gekenmerkt en geverifieerd als puur door UV-vis en IR spectroscopie. De mitochondriale calcium opname remmende eigenschappen worden beoordeeld in permeabel HeLa cellen door fluorescentiespectroscopie.
Introduction
Mitochondriale calcium is een belangrijke regulator voor een aantal processen die essentieel voor normale cel functie zijn, met inbegrip van energieproductie en apoptosis. 1 , 2 , 3 de mitochondriale calcium uniporter (MCU), een ion vervoerder eiwit dat zich op de innerlijke mitochondriale membraan bevindt, regelt de toestroom van calciumionen in de mitochondriën. 4 , 5 , 6 chemische inhibitoren van de MCU zijn waardevolle hulpmiddelen voor de voortzetting van de inspanningen om de functie en cellulaire rollen van dit vervoer eiwit en mitochondriale calcium te studeren. De samengestelde [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, is een van de enige bekende selectieve inhibitors voor het MCU met een gerapporteerde Kd waarde van 24 µM.7 ,8,9,10 dit complex een gemeenschappelijk onzuiverheid gevonden in commerciële formuleringen van ruthenium rood (RuRed), een triruthenium di-µ-oxo is hexacation van de formule [(NH3) overbrugd 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die ook is gebruikt als een calcium opname inhibitor. Hoewel Ru360 commercieel beschikbaar is, is het zeer duur. Bovendien, de synthese en de isolatie van de Ru360 wordt uitgedaagd door moeilijk zuiveringsprocedures en dubbelzinnige karakteriseringsmethoden.
Alternatieve procedures voor toegang tot een Ru360 analoge, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5hebben we onlangs gemeld. 11 deze stof remt de MCU met hoge affiniteit, vergelijkbaar met Ru360. In dit protocol beschrijven we onze meest effectieve synthese van dit samengestelde, die met [Ru (NH3)5Cl] Cl2 begint. Zuivering van het product met behulp van sterk zure kationenwisselingshars is gedetailleerd, samen met de gemeenschappelijke valkuilen voor deze procedure. Wij presenteren methoden voor karakterisering en evaluatie van samengestelde zuiverheid, en een eenvoudige benadering om te testen zijn werkzaamheid in het blokkeren van mitochondriale calcium opname af te bakenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mitochondriale calcium opname remmer [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan worden gesynthetiseerd uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2, een bekende ruthenium(III) grondstof, zoals beschreven in deze procedure. De synthese van [Ru (NH3)5Cl] Cl2 wordt gemakkelijk bereikt met weinig moeite. Hydrateren na roeren RuCl3 voor 16u in hydrazine, de pH van de oplossing moet worden a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Cornell University. Dit werk maakte gebruik van de Cornell Center voor materialen gedeelde onderzoeksfaciliteiten, die worden ondersteund door de NSF MRSEC programma (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkent ondersteuning via een NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE – 1650441) en Dr. Dave Holowka voor hulp bij de calcium-experimenten. Mening, bevindingen, en conclusies of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs (s) en weerspiegelen niet noodzakelijk de standpunten van de National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
Riferimenti
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochimica. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
