בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

המקרופאגים הם מסתובבים תאים phagocytic מיוחדים לזהות, לבלוע, לבזות את כל החלקיקים הזרים נוכח ברקמות היקפיים, החל מוות תאים כדי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים פולשים. על פני השטח קולטן בתיווך זיהוי של סמנים הפתוגן הספציפי הנוכחי בדרך כלל על פני השטח של מיקרואורגניזמים (המכונה פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרי או PAMPs), מקרופאגים ליזום ומורכב של הממברנה התאית ב סדר כדי להקיף את הפתוגן¹phagocytize.

הפתוגן אפף נכלל אז על ידי מקרופאג ב שלפוחית תאיים המכונה phagosome. דרך סדרה של פיוז’ן ואירועים ביקוע עם שלפוחית אחרים כגון endosomes ו- lysosomes, phagosome פתוגן המכיל רוכש ערכה של חלבונים הדרושים עבור חיסול של התוכן phagosomal. לכן, ההרכב אנזימטי של phagosome זה משתנה מאוד במהלך תהליך זה, המכונה ההבשלה phagosome².

זמן קצר לאחר phagocytosis, multimeric ATPase vacuolar מורכבים (v-ATPase) הוא שולב קרום phagosome על ידי היתוך עם endosomes³. מתחם זה מנצל ATP כדי משאבת הפרוטונים מ ציטוזול כדי לומן של phagosome⁴. לחומצי phagosome חיוני עבור האירועים פיוז’ן עם אחרים שלפוחית⁵ , הפעלת מספר רב של אנזימים degradative תלויי-pH⁶. עוד מתחם אנזימטי multimeric במהירות שמתארגנת על קרום phagosome הוא המתחם nadph לאוקסידאז (NOX). NOX מורכבים מתחמצן nadph על מנת לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) זה מופרשים לתוך לומן phagosome ואשר תורמות באופן משמעותי הריגתו של מיקרואורגניזמים אפף⁷.

במהלך השלבים הראשונים של התבגרות, phagosomes להציג סמני בדרך כלל כגון Rab5 ו- Rab7 של endosomes מוקדמות ומאוחרות בהתאמה יחד עם יחידת משנה₀ V של v-ATPase⁸. פיוז’ן של phagosomes עם lysosomes ו- endosomes מאוחר תוצאות חשיפת המחלה phagocytized למגוון רחב של אנזימים hydrolytic כגון cathepsin פרוטאזות, lipases וβ-galactosidase⁹. לחומצי לומן נדרש גם ההפעלה של אנזימים אלה. לדוגמה, המחשוף של cathepsin D כדי לייצר טופס קצר פעיל הוא תלוי-pH¹⁰. אנזימים אלה לבזות את הפתוגן ולסיים את הייצור של פפטידים קצרים, נגזר הפתוגן מוצגים על ידי מקרופאג histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II מולקולות בתאי T כדי לעורר תגובה חיסונית אדפטיבית¹¹.

לפיכך, phagosome ההבשלה הוא קריטי עבור התגובה החיסונית מולדת וקישורים הזרועות מולדת, גמישים של המערכת החיסונית. . זה לא מפתיע כי פתוגנים התפתחו אסטרטגיות כדי להתגבר על חיסול על ידי מקרופאגים לאורך התהליך המתואר לעיל של התבגרות phagosome… לדוגמה, החיידק תאיים שחפת Mycobacterium , הלגיונלה pneumophila למנוע ההבשלה phagosome על ידי מעכבים v-ATPase הרכבה ו לומן הסוגר acidification^12,13 . חיידקים אחרים, כגון ליסטריה או שיגלה flexneri זירוז היווצרות נקבובית ממברנה phagosome להימלט אל ציטוזול ה-^14,15. לעומת זאת, serovar enterica סלמונלה typhimurium (S. typhimurium) הוא מסוגל לשנות את המאפיינים של phagosome בתוך חלולית להפכו במיקום מתאים עבור שכפול שלו¹⁶. יכולת זו גורם S. typhimurium מודל מאוד מעניין ללמוד בתיווך הפתוגן הפרעה של התבגרות phagosome.

ס typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, ס חיידקים Typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הנכלל phagosomes¹⁷. כמה דיווחים בעבר תיארו את ס typhimurium-phagosomes המכיל להציג למקבלי הן endosomes והן lysosomes¹⁸, מחקרים אחרים מצאו ליזוזום phagosome פיוז’ן מנעה על ס זיהום Typhimurium¹⁹.

בתחילה, phagosome ההבשלה על ס זיהום typhimurium נחקר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. התפתחות טכניקות בידודו של המכילים חיידקים phagosomes התומך מחקר מדויק יותר של התוכן phagosome במונחים של סמנים אנדוזום, ליזוזום. נכון להיום, שיטת העיקרי המשמש את ניתוקה של המכילים חיידקים phagosomes הוא fractionation subcellular^18,מעברי צבע של סוכרוז שלב²⁰. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר השלבים צנטריפוגה זה יכול לגרום לנזק מכני phagosomes, יכול להשפיע על היציבות של רכיבים phagosomal (חלבונים ושומנים), הוא זמן רב. יתר על כן, זה דורש את השימוש ultracentrifuge: פיסת ציוד מיוחד שאינו נגיש עבור כל מעבדה.

לאחרונה הוחל גישה חדשה את בידודה של בקטריאלי המכיל phagosomes, שבו פתוגנים חיידקיים מסומנות עם biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ומאוחר יותר חילוץ באמצעות streptavidin מצומדת beads מגנטי²¹ . אנו מציעים שיטה משלימה חלופית על-ידי תיוג חיידקי משטח המכיל amine מקרומולקולות עם NHS-ביוטין ואחריו streptavidin מצומדת beads מגנטי. Phagosomes המתקבלות בשיטה זו מאוד מועשרים בסמני אנדוזום, ליזוזום והוא יכול לשמש למגוון רחב של מבחני, מניתוח חלבון טכנולוגיות לניתוח. בנוסף, זה אינו מצריך ציוד מיוחד כגון ultracentrifuges. יתר על כן, על ידי ביטול השלבים צנטריפוגה, הנזק מכני phagosomes והן את כמות הזמן המועסקים הם מופחת במידה ניכרת. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של phagosomes המכילה חיידקים אחרים, כגון גראם חיוביים Staphylococcus aureus, כללה גם כתב יד זה. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes הוא משחק פשוט, חסכוני, חינוך, פחות זמן רב יותר הבידוד קלאסית מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation, עיבוד מאוד המכיל חיידקים phagosomes.