Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración
Summary
Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.
Abstract
Las enfermedades neurodegenerativas se asocia frecuentemente a una progresiva pérdida de capacidad de movimiento, menor vida útil y neurodegeneración dependiente de la edad. Para entender el mecanismo de estos celulares eventos y sus relaciones causales con otros, Drosophila melanogaster, con sus sofisticadas herramientas genéticas y características conductuales diversas, se utilizan como modelos de enfermedades para evaluar fenotipos de neurodegenerativas. Aquí describimos un método de alto rendimiento para analizar el comportamiento de adultos geotaxis negativa de Drosophila , como una indicación de posibles defectos motor asociado a la neurodegeneración. Una máquina automatizada es diseñado y desarrollado para sincronización de mosca en coche mediante un impulso eléctrico inicial, más adelante lo que permite la grabación de comportamiento geotaxis negativa en un transcurso de segundos a minutos. Imágenes de la video grabado digitalmente luego son procesadas con el software de RflyDetection diseñado para la manipulación de datos estadísticos. A diferencia del ensayo manualmente controlados geotaxis negativa basado en volar sola, este protocolo precisa, rápida y de alto rendimiento permite la adquisición de datos más que centenares de moscas al mismo tiempo, proporcionando un enfoque eficiente para avanzar en nuestra comprensión en el mecanismo subyacente del aparato locomotor déficit asociado a la neurodegeneración.
Introduction
Una variedad de protocolos y métodos han sido desarrollados para analizar comportamiento de escalada adultos de Drosophila . Bastante laborioso, el análisis tradicional sobre todo poner una sola mosca en un frasco individual y utiliza una fuerza manual para moscas abajo de sincronización1,2,3,4. Es tedioso y lento, inadecuado para grandes estudios de alto rendimiento y tiene posibles variaciones de la fuerza manual utilizada para golpear ligeramente las moscas así como otras limitaciones. Para mejorar el análisis, se desarrolló un ensayo rápido iterativo Geotaxis negativa (anillo) que permite el análisis de alto rendimiento en numerosas moscas en el mismo tiempo5. Sin embargo, el ensayo requiere todavía una fuerza ejercer manualmente para sincronizar la acción de volar. Nuestra versión de la prueba de anillo, revisada en el ensayo anterior, incluye una base metálica que aloja múltiples frascos que contienen la mosca controlados automáticamente por un motor eléctrico para conducir sincronización mosca6. A grabación, la mosca sube inmediatamente después de sincronización se graba entonces analizado usando un software de diseño propio. Nuestro análisis automatizado del anillo ha eliminado el proceso tedioso y requiere mucho trabajo en la recogida de datos de una sola mosca, uno a la vez y permitió el proceso de adquisición de datos ser más eficientes. Además, se ha empleado el análisis automatizado del anillo en un número de estudios para aclarar el mecanismo subyacente enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, validar el enfoque con eficacia alta7,8,9 .
En este artículo, se demuestra el ensayo de anillo automatizado usando el DDC-Gal4 impulsado por moscas de RNAi. DDC-Gal4 es una línea de Gal4 expresando específicamente en dopaminérgicas (DA) y de neuronas serotoninérgicas, lo que representa una gran herramienta para el análisis de los efectos de gen de destino asociados a déficit locomotor acompañando a neurodegeneración10. Además, incorporamos Dicer2 UAS, una línea de mosca que mejora la eficacia de ARNi, para generar el UAS-Dicer2; DDC-Gal4 línea de la herramienta. Las moscas de RNAi que decide usar es auxilin (aux) v16182 de RNAi (auxR16182), un gen que previamente hemos identificado para exhibir un efecto de volar locomotor actividad8. auxGFP moscas también están preparados para analizar los efectos sobre la sobreexpresión de aux . Mostraremos cómo utilizar el análisis automatizado de anillo para medir fly geotaxis negativos, presentar los resultados y discutir cualquier implicación de los resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis automatizado de anillo descrito aquí permite un análisis de alto rendimiento del comportamiento de la mosca geotaxis negativa por cientos de moscas al mismo tiempo. Previamente las estrategias existentes para el análisis de escalada adulto implican observaciones de una sola mosca en un frasco individual y posición de volar manualmente es detectado por el ojo. Este proceso algo tedioso a veces puede causar mala interpretación o mala interpretación de los datos, así como trabajos que requieren mucho tra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al centro de Stock de Bloomington y el centro de Viena Drosophila RNAi para las poblaciones de mosca. La patente para el aparato de anillo pertenece a Instituto de investigación de avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias. Las solicitudes para el software de RflyDetection debe hacerse a Huang Fu-de (ver lista de autor). Este trabajo fue financiado por becas del programa nacional de investigación básica de China (973 programa 2013CB945602) y la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31270825 y 31171043). Agradecemos a los miembros de laboratorio de Ho para discusión y comentarios.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Riferimenti
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- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
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- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
