Автоматизированный быстрого итеративного негативные Geotaxis Assay для анализа поведения взрослых восхождение в модели дрозофилы нейродегенеративные
Summary
Этот шаг за шагом протокола анализирует поведение отрицательных geotaxis дрозофилы , с использованием автоматизированной системы многоцилиндровых, которая содержит сотни мух и синхронизирует их действий, электродвигатель. После синхронизации assayed летать негативные geotaxis поведение, записанные в цифровом формате и проанализированы с помощью RflyDetection программного обеспечения собственной разработки.
Abstract
Нейродегенеративные заболевания часто связаны с постепенной утратой способности движения, сокращение продолжительности жизни и нейродегенеративные зависит от возраста. Чтобы понять механизм клеточного этих событий и их причинно-следственных связей друг с другом, Drosophila melanogaster, с его сложных генетических инструментов и разнообразных поведенческих особенностей, используются в качестве модели заболеванием для оценки нейродегенеративных фенотипов. Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью анализировать поведение взрослых негативные geotaxis дрозофилы , как признак для возможных моторных дефектов, связанных с нейродегенеративные. Автомат разработан и создан для привода летать синхронизации с использованием первоначальный Электрический импульс, затем позволяя запись негативного geotaxis поведения течение секунд до минут. Изображения из цифровой записи видео затем обрабатываются с помощью собственной разработки программного обеспечения RflyDetection для обработки статистических данных. В отличие от управляемые вручную негативные geotaxis assay основанный на один летать, этот точные, быстрые и высок объём протокол позволяет сбора данных из более чем сотни мух одновременно, обеспечивая эффективный подход для продвижения наших понимание в основной механизм двигательного дефицита, связанные с нейродегенеративные.
Introduction
Целый ряд протоколов и методов были разработаны для анализа дрозофилы взрослых восхождение поведения. Довольно трудоемким, традиционный анализ главным образом включает в себя положить один летать в отдельных флакона и использует ручной силы для коснитесь летит вниз для синхронизации1,2,3,4. Это утомительно и времени, не подходит для крупных высок объём исследований и имеет потенциал вариантов ручной силы для нажмите вниз мух, а также другие ограничения. Чтобы улучшить assay, пробирного быстрого итеративного негативные Geotaxis (кольцо) была разработана, который позволяет высок объём анализ многочисленных мух на же время5. Однако проба по-прежнему требует вручную оказания силы для синхронизации летать действий. Наша версия кольцо assay, пересмотрен после предыдущего анализа, включает в себя металл базу хостинг несколько летать содержащих флаконов, автоматически контролируется электродвигатель ездить летать синхронизации6. После записи, Муха, восхождение сразу после синхронизации регистрируется затем анализируются с помощью собственной разработки программного обеспечения. Наша автоматизированная пробирного кольцо устранила утомительным и трудоемким процессом сбора данных от одной мухи, один в то время и включен процесс сбора данных быть более эффективным. Кроме того в ряде исследований для выяснения механизма основной Альцгеймера и Паркинсона, проверка подход с высокой эффективностью7,8,9 был нанят автоматизированных assay кольцо .
В этой статье мы демонстрируем автоматизированных пробирного кольцо, с помощью DDC-Gal4 инициативе RNAi мух. DDC-Gal4 линия Gal4 конкретно выражая дофаминергической (DA) и серотонинергической нейронов, таким образом представляя большой инструмент для анализа целевого гена эффекты, связанные с двигательного дефицита, сопровождающих нейродегенеративные10. Кроме того мы внедряем Бла-Dicer2, летать линии, что повышает эффективность интерференции, сформировать бла-Dicer2; DDC-Gal4 инструмент линия. RNAi мух, мы решили использовать это auxilin (aux) v16182 интерференции (auxR16182), ген, который мы определили ранее выставлять влияние на двигательную активность8летать. для анализа воздействия на aux гиперэкспрессия готовы также auxGFP мух. Мы покажем как использовать автоматизированные кольца assay измерить летать негативные geotaxis, результаты и обсудить любые последствия, полученные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Автоматизированных пробирного кольцо, описанные здесь позволяет одновременно высок объём анализ поведения летать негативные geotaxis сотни мух. Ранее существующих стратегий для анализа взрослых восхождение включать замечания одной мухи в отдельных во флаконе, и летать позиция определя?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Блумингтон фондовой центр и Венский центр RNAi дрозофилы летать запасов. Патент на кольцо аппарат принадлежит к Шанхай передовых научно-исследовательский институт, Китайской академии наук. Просит за RflyDetection программное обеспечение должно быть Фу-де-Хуан (см. список авторов). Эта работа была поддержана грантов от национальной программы базовых исследований Китая (973 программы 2013CB945602) и национальные естественные науки фонд Китая (31270825 и 31171043). Мы благодарим членов Хо лаборатории для обсуждения и комментариев.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Riferimenti
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
