Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração
Summary
Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.
Abstract
Doenças neurodegenerativas são frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento, esperança de vida reduzida e neurodegeneração idade-dependente. Para entender o mecanismo celular esses eventos e suas relações causais com o outro, Drosophila melanogaster, com as suas sofisticadas ferramentas de genéticas e diversas características comportamentais, são usadas como modelos de doença para avaliar neurodegenerativas fenótipos. Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para analisar o comportamento de adultos geotaxis negativo de Drosophila , como uma indicação para possíveis defeitos motor associado a neurodegeneração. Uma máquina automatizada é projetada e desenvolvida para sincronização de mosca de unidade usando um impulso elétrico inicial, mais tarde, permitindo a gravação de comportamento negativo geotaxis sobre um curso de segundos a minutos. Imagens do vídeo digitalmente gravado então são processadas com o software RflyDetection concebido para manipulação de dados estatísticos. Diferente do ensaio geotaxis negativo manualmente controlado com base em uma única mosca, este protocolo preciso, rápido e alta produtividade permite a aquisição de dados de mais do que centenas de moscas simultaneamente, proporcionando uma abordagem eficiente para avançar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de locomoção déficits associados a neurodegeneração.
Introduction
Uma variedade de protocolos e métodos foram desenvolvidos para analisar o comportamento de escalada adulto de Drosophila . Um pouco trabalhosa, a análise tradicional principalmente envolve a colocação de uma única mosca dentro de um frasco de individual e usa uma força manual para tocar voa para baixo para a sincronização1,2,3,4. É tedioso e demorado, impróprios para grandes estudos de alta produtividade e tem potenciais variações da força manual usado para bater para baixo as moscas, bem como outras limitações. Para melhorar o ensaio, um ensaio rápido iterativo negativo Geotaxis (anel) foi desenvolvido, que permite alta produtividade análise sobre numerosas moscas no mesmo tempo5. No entanto, o ensaio ainda requer uma força exercer manualmente para sincronizar a voar para ação. Nossa versão do ensaio do anel, revisado com o ensaio anterior, inclui uma base de metal Hospedagem de vários frascos contendo mosca controlados automaticamente por um motor elétrico para conduzir a sincronização voar6. Após a gravação, a mosca subindo imediatamente após a sincronização é gravada então analisados usando um software concebido. Nosso ensaio de anel automatizado eliminou o processo tedioso e trabalho intensivo em coletar dados de uma única mosca, um de cada vez e habilitado para o processo de aquisição de dados para ser mais eficiente. Além disso, o ensaio automatizado do anel tem sido empregado em uma série de estudos para elucidar a mecanismo subjacente a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, validando a abordagem com alta eficiência7,8,9 .
Neste artigo, vamos demonstrar o ensaio automatizado de anel usando o DDC-Gal4 conduzido RNAi moscas. DDC-Gal4 é uma linha de Gal4 especificamente expressando em dopaminérgico (DA) e neurônios serotoninérgicos, representando assim uma ótima ferramenta para analisar os efeitos do gene alvo associados com déficits locomotoras neurodegeneração10de acompanhamento. Além disso, incorporamos UAS-Dicer2, uma linha de mosca que aumenta a eficiência de RNAi, para gerar o UAS-Dicer2; DDC-Gal4 ferramenta linha. As moscas de RNAi escolhemos usar é o auxilin (aux), v16182 de RNAi (auxR16182), um gene que anteriormente identificamos para expor um efeito na atividade locomotora8de voar. auxGFP moscas também são preparadas para analisar os efeitos sobre a superexpressão de aux . Vamos mostrar como usar o ensaio automatizado do anel para medir mosca geotaxis negativa, apresentar os resultados e discutir quaisquer implicações que adquiriu a partir dos resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de anel automatizado descrito aqui permite uma análise do elevado-throughput de comportamento de voar geotaxis negativo para centenas de moscas simultaneamente. Anteriormente estratégias existentes para a análise de escalada adulto envolvem observações de uma única mosca em um frasco individual e posição voar manualmente é detectada pelo olho. Este processo um pouco tedioso às vezes pode causar má interpretação ou má interpretação de dados, bem como trabalho trabalhoso. Nosso ensaio automatizado …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o centro de estoque de Bloomington e centro de RNAi Viena drosófila para estoques de voar. A patente para o aparelho de anel pertence ao Instituto de pesquisas avançadas de Xangai, da Academia Chinesa de Ciências. Pedidos de software RflyDetection deve ser feito para Fu-de Huang (ver lista de autor). Este trabalho foi apoiado por concessões do nacional básica pesquisa programa de China (973 programa 2013CB945602) e Nacional Natural Science Foundation da China (31270825 e 31171043). Agradecemos a membros de laboratório Ho para discussão e comentários.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Riferimenti
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