Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione
Summary
Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.
Abstract
Malattie neurodegenerative sono associate frequentemente con una progressiva perdita di capacità di movimento, durata della vita ridotta e neurodegenerazione età-dipendente. Per capire il meccanismo di questi cellulari eventi e loro relazioni causali con a vicenda, Drosophila melanogaster, con i suoi sofisticati strumenti genetici e diverse caratteristiche comportamentali, vengono utilizzati come modelli di malattia per la valutazione neurodegenerative fenotipi. Qui descriviamo un metodo di alto-rendimento per analizzare il comportamento di adulto geotassi negativa di Drosophila , come un’indicazione per eventuali difetti motore associato di neurodegenerazione. Una macchina automatica è stata progettata e sviluppata per la sincronizzazione volare utilizzando un iniziale impulso elettrico, più tardi che permette la registrazione del comportamento negativo geotassi sopra un corso di secondi per minuti in auto. Immagini dal video registrata digitalmente vengono poi elaborati con il software RflyDetection self-progettato per la manipolazione di dati statistici. Diverso del dosaggio controllato manualmente geotassi negativa basata su singolo fly, questo protocollo preciso, veloce e ad alta velocità permette l’acquisizione di dati da più di centinaia di mosche fornendo al contempo, un approccio efficace per far avanzare la nostra comprensione nel meccanismo sottostante dei deficit motorio associato a neurodegenerazione.
Introduction
Una varietà di protocolli e metodi sono stati sviluppati per analizzare il comportamento di arrampicata adulto della drosofila . Piuttosto laborioso, l’analisi tradizionale principalmente consiste nel mettere una singola Mosca in una fiala di singola e utilizza una forza manuale per toccare mosche giù per sincronizzazione1,2,3,4. È noioso e richiede tempo, inadatto per i grandi studi di alto-rendimento ed ha potenziale variazioni della forza manuale utilizzato per toccare giù le mosche, così come altre limitazioni. Per migliorare il test, un test rapido iterativo geotassi negativa (anello) è stato sviluppato che permette l’analisi di alto-rendimento sopra numerose mosche al tempo stesso5. Tuttavia, il test richiede comunque una forza manualmente esercitando per sincronizzare volare azione. La nostra versione del test RING, riveduto al momento l’analisi precedente, comprende una base di metallo hosting più flaconcini contenenti volare controllate automaticamente da un motore elettrico a guidare volare sincronizzazione6. Al momento della registrazione, al volo arrampicata immediatamente dopo sincronizzazione è registrato poi analizzato utilizzando un software di auto-progettato. Il nostro saggio anello automatizzato ha eliminato il processo noioso e laborioso nella raccolta di dati da un singolo fly, uno alla volta e attivato il processo di acquisizione di dati essere più efficiente. Inoltre, il test automatizzato di anello è stato impiegato in una serie di studi per delucidare il meccanismo sottostante Alzheimer e morbo di Parkinson, convalida l’approccio con alta efficienza7,8,9 .
In questo articolo, dimostriamo il test automatizzato anello utilizzando la DDC-Gal4 guidato RNAi mosche. DDC-Gal4 è una linea di Gal4 specificamente esprimendo in (DA) neuroni dopaminergici e serotoninergici, rappresentando quindi un ottimo strumento per analizzare gli effetti del gene bersaglio associati a deficit motorio che accompagna la neurodegenerazione10. Inoltre, incorporiamo UAS-Dicer2, una linea di volo che migliora l’efficienza di RNAi, per generare il UAS-Dicer2; DDC-Gal4 strumento linea. Le mosche di RNAi scegliamo di usare è il auxilin (aux), RNAi v16182 (auxR16182), un gene che precedentemente abbiamo identificato per esporre un effetto su attività locomotrice8per volare. auxGFP mosche sono preparati anche per analizzare gli effetti sopra aux sovraespressione. Mostreremo come utilizzare il test automatizzato di anello per misurare volare geotassi negativa, presentare i risultati e discutere eventuali implicazioni acquisite dai risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test automatizzato anello qui descritto consente un’analisi di alto-rendimento del comportamento di volare geotassi negativa per centinaia di mosche contemporaneamente. In precedenza strategie esistenti per l’analisi di arrampicata adulti comportano l’osservazione di una singola Mosca in un singolo flaconcino, e volare posizione manualmente viene rilevata dall’occhio. Questo processo piuttosto noioso a volte potrebbe causare fraintendimento o errata interpretazione dei dati, come pure laborioso lavoro. Nostra analisi …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Bloomington Stock Center e il centro Vienna RNAi della drosofila per stock di volare. Il brevetto per l’apparato di anello appartiene a Shanghai Advanced Research institute, Accademia cinese delle scienze. Le richieste per il software di RflyDetection dovrebbe essere fatto per Fu-de Huang (Vedi lista dell’autore). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca base nazionale della Cina (973 programma 2013CB945602) e National Natural Science Foundation of China (31270825 e 31171043). Ringraziamo i membri del laboratorio Ho per discussioni e commenti.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Riferimenti
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