Un dosage automatisé rapide géotaxie négative itérative pour analyser le comportement d’escalade adultes dans un modèle drosophile de la neurodégénérescence
Summary
Ce protocole étape par étape analyse le comportement de géotaxie négative de drosophile à l’aide d’un système automatisé de multicylindre qui héberge des centaines de mouches et synchronise leur action par un moteur électrique. Lors de la synchronisation, comportement de la mouche géotaxie négative est analysé, enregistrés numériquement et analysées en utilisant le logiciel RflyDetection individu-conçu.
Abstract
Les maladies neurodégénératives sont fréquemment associées à une perte progressive de la capacité de mouvement, la durée de vie réduite et neurodégénérescence âge-dépendante. Pour comprendre le mécanisme cellulaire ces événements et leurs relations causales entre eux, Drosophila melanogaster, avec ses outils génétiques complexes et diverses caractéristiques comportementales, sont utilisées comme modèles de maladies pour évaluer neurodégénératives phénotypes. Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour analyser le comportement de drosophile adulte géotaxie négative, comme une indication pour d’éventuels vices moteurs associé de neurodégénérescence. Une machine automatisée est conçue et développée à la synchronisation de mouche en voiture à l’aide d’une impulsion électrique initiale, plus tard ce qui permet l’enregistrement de comportement géotaxie négative sur un parcours de secondes à minutes. Images de la vidéo enregistrée numériquement sont ensuite traitées avec le logiciel RflyDetection individu-conçu pour la manipulation de données statistiques. Différent de l’essai de commande manuelle géotaxie négative basé à volée unique, ce protocole précis, rapide et haut-débit permet d’acquisition de données de plus de centaines de mouches en même temps, fournissant une approche efficace pour faire progresser notre comprendre le mécanisme sous-jacent de déficits locomoteurs liés à la neurodégénérescence.
Introduction
Une variété de protocoles et méthodes ont été développées pour analyser le comportement escalade adulte de drosophile . Plutôt laborieux, l’analyse traditionnelle pour la plupart consiste à introduire une seule mouche dans un flacon individuel et utilise une force manuelle pour robinet mouches vers le bas pour la synchronisation1,2,3,4. C’est fastidieux et chronophage, inadapté pour des études de haut débit grande et a des variations potentielles de la force manuelle utilisée pour taper sur les mouches, mais aussi les autres limitations. Pour améliorer le dosage, un rapide géotaxie négative itératif (RING) a été développé qui permet l’analyse de haut-débit au fil de nombreuses mouches dans le même temps5. Toutefois, le dosage nécessite toujours une force exerçant manuellement pour synchroniser l’action voler. Notre version de l’essai de l’anneau, révisé lors de l’essai précédent, comprend une base métallique hébergement plusieurs flacons contenant du mouche contrôlées automatiquement par un moteur électrique à entraînement synchronisation volant6. Dès l’enregistrement, la mouche montée immédiatement après que synchronisation est enregistrée puis analysées à l’aide d’un logiciel autonome conçu. Notre essai automatisé de RING a éliminé le processus fastidieux et fastidieux à collecter des données d’une seule mouche, un à la fois et activé le processus d’acquisition de données d’être plus efficace. En outre, le test automatisé de RING a été employé dans un certain nombre d’études visant à élucider le mécanisme sous-jacent de maladie d’Alzheimer et de Parkinson, valider l’approche avec le rendement élevé7,8,9 .
Dans cet article, nous démontrons l’essai anneau automatisé à l’aide de la DDC-Gal4 piloté par ARNi mouches. DDC-Gal4 est une ligne de Gal4 exprimant spécifiquement dans dopaminergique (DA) et les neurones sérotoninergiques, ce qui représente un excellent outil pour analyser les effets du gène cible associées à des déficits locomoteurs accompagnant la neurodégénérescence10. En outre, nous incorporons SAMU-Dicer2, une ligne de mouche qui améliore l’efficacité de l’ARNi, pour générer le SAMU-Dicer2 ; DDC-Gal4 outil ligne. Les mouches d’Arni, nous choisissons d’utiliser est auxilin (aux), Arni v16182 (auxR16182), un gène que nous avons précédemment identifiées afin de présenter un effet sur voler l’activité locomotrice,8. auxGFP mouches sont également préparés pour analyser les effets sur la surexpression aux . Nous allons montrer comment utiliser le test automatisé de RING pour mesurer mouche géotaxie négative, présenter les résultats et discuter des implications acquises à partir des résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage d’anneau automatisé décrit ici permet une analyse de haut-débit du comportement de la mouche géotaxie négative pour des centaines de mouches simultanément. Auparavant les stratégies existantes pour l’analyse d’escalade adultes impliquent des observations d’une mouche simple dans un flacon individuel et mouche position est détectée manuellement par oeil. Ce processus plutôt fastidieux peut provoquer parfois mauvaise interprétation ou une mauvaise interprétation des données, ainsi que des tra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Bloomington Stock Center et le centre de RNAi de drosophile de Vienne pour les stocks de mouche. Le brevet pour l’appareil de l’anneau appartient à Shanghai Advanced Research Institut, Académie chinoise des Sciences. Prie pour le logiciel de RflyDetection doit être fait à Fu-de Huang (voir la liste de l’auteur). Ce travail a été soutenu par des subventions du National programme base de recherche de Chine (973 programme 2013CB945602) et la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31270825 et 31171043). Nous remercions les membres du labo Ho pour discussion et commentaires.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Riferimenti
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