Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal
Summary
Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.
Abstract
Un método primario utilizado para definir la presencia de neutrófilos trampas extracelulares (redes) es la microscopia confocal. Hemos modificado microscopía confocal establecido métodos para visualizar las trampas extracelulares del macrófago (MET). Estas trampas extracelulares se definen por la presencia de cromatina extracelular con coexpresión de otros componentes como gránulo proteasas, las histonas citrulinado y peptidil arginasa deiminase (PAD). La expresión de METs es generalmente medida después de la exposición a un estímulo y en comparación con muestras no estimuladas. Las muestras también se incluyen para el control del fondo y el isotipo. Las células son analizadas utilizando el software de análisis de imagen bien definida. La microscopia confocal puede utilizarse para definir la presencia de METs en vitro y en vivo en el tejido pulmonar.
Introduction
Neutrófilos trampas extracelulares (redes), primero fueron descritos por Brinkmann et al. 1 que predominantemente se producen en respuesta a la infección (especialmente a las bacterias) y tienen un papel importante en host defense1,2. También se han descrito para ocurrir en respuesta a enfermedades no infecciosas, incluyendo vasculitis y lupus eritematoso sistémico (les); y a los mitógenos forbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Se ha reconocido recientemente que otros tipos celulares pueden también producir trampas extracelulares, incluyendo los macrófagos. Trampas extracelulares del macrófago (MET) todavía no son una entidad bien definida en la literatura4,5. Recientemente hemos establecido los métodos para detectar la presencia de METs tanto in vitro e in vivo6,7. En este artículo, se describen la medida de METs usando microscopia confocal.
Características clave de NETosis que la distinguen de otras vías celulares (tales como apoptosis8) son la extrusión de la cromatina en relación con: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) la expresión de proteasas de gránulo10 y (3) participación de peptidil arginina deiminase (PAD) 411,12. Macrófagos también expresan H3Cit, proteasas de gránulo y almohadilla, y estas características pueden utilizarse para definir la presencia de METs.
METs de pueden tener un papel particularmente importante en el pulmón, como el macrófago es la célula dominante presente en los alvéolos y las vías respiratorias del pulmón y tiene la función inicial en la dirección del cellular la respuesta inmune a la infección/inflamación. Además, mientras que gran parte del pulmón es espacio vacío (por ejemplo, dentro de los alvéolos), los METs son potencialmente capaces de expandirse en el espacio disponible, a diferencia de órganos sólidos.
El método más utilizado para definir la presencia de redes es mediante microscopía confocal. Aún no existe una forma claramente definida para medir METs. La técnica para la medición de redes ha sido adaptada para medir la presencia de METs en el presente Protocolo. Los principales requisitos para este método son el acceso a la microscopia confocal y el software apropiado de imágenes para análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en este informe se basa en que para la determinación de la presencia de redes14. Los macrófagos son el tipo celular dominante en muestras de BAL y este método de colección es especialmente adecuado para el estudio de METs. Si glóbulos rojos están presentes en el BAL, estas células deben lisis mediante el uso de cloruro de amonio. El procedimiento de BAL generalmente activa los macrófagos y por lo tanto se espera que habrá METs presentes en las muestras no estimuladas. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Monash, la salud nacional y Consejo de investigación médica y el pulmón de Monash e Instituto del sueño. Los autores desean dar las gracias al personal de inmunología clínica en salud de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass y Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) ayuda con la microscopía confocal de imágenes, y los autores reconocen las instalaciones MMI de la Universidad de Monash. Los autores reconocen las instalaciones y asistencia científica y técnica de la plataforma de la histología de Monash.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
Riferimenti
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
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