Detta är ett protokoll att studera intracellulära protein-protein interaktioner baserat på biotin-metoden nedrullningsbara systemet med nyheten att kombinera cell-penetrerande sekvenser. Den största fördelen är att sekvensen mål inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför interaktioner sker inom ramen för cellulära.
Här presenterar vi ett protokoll för att studera intracellulära protein-protein interaktioner som baseras på allmänt använda biotin-metoden nedrullningsbara systemet. Den ändring som presenteras omfattar kombinationen av denna teknik med cell-penetrerande sekvenser. Vi föreslår att utforma cell-penetrerande beten som kan inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför de interaktioner som hittade kommer att återspegla de som uppstår inom ramen för intracellulära. Connexin43 (Cx43), ett protein som bildar gap junction kanaler och hemichannels är ned-reglerade i höggradigt gliom. Regionen Cx43 bestående av aminosyror 266-283 ansvarar för hämning av onkogena aktiviteten av c-Src i glioma celler. Här använder vi TAT som cell-penetrerande sekvens, biotin som taggen nedrullningsbara och regionen av Cx43 mellan aminosyror 266-283 som mål att hitta intracellulära interaktioner i hård-till-transfect mänskliga glioma stamcellerna. En av begränsningarna i den föreslagna metoden är att molekylen används som bete kan misslyckas att vika ordentligt och, följaktligen, de interaktioner som hittade inte kunde associeras med effekten. Dock kan denna metod vara särskilt intressant för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de utförs oftast av egensäkra oordnade regioner och, därför de inte kräver en ordnad vikning. En av fördelarna med den föreslagna metoden är dessutom att relevansen av varje rester på interaktionen kan studeras enkelt. Detta är ett modulärt system; Därför kan andra cell-penetrerande sekvenser, andra taggar och andra intracellulära mål vara anställd. Slutligen, omfattningen av detta protokoll är långt bortom protein-protein interaktioner eftersom detta system kan tillämpas på andra bioaktiva laster såsom RNA sekvenser, nanopartiklar, virus eller någon molekyl som kan vara sensorik med cell-penetrerande sekvenser och smält till pull-down-taggar för att studera deras intracellulära verkningsmekanism.
Protein-protein interaktioner är väsentliga för en stor variation av cellulära processer. För att fullt förstå dessa processer, krävs metoder för att identifiera proteininteraktioner inom komplexa intracellulära miljön. En av de mest använda metoderna att identifiera interaktion partner av ett protein är att använda det proteinet eller en mimetisk peptid av en del av det proteinet som bete i affinitet nedrullningsbara experiment följt av upptäckt av bindande proteiner. Avidinen-biotin systemet används ofta på grund av hög affinitet, specificitet och stabil samverkan mellan avidinen och biotin1,2. Vanligtvis, biotin är kovalent bundna till betet (protein eller peptid) och efter en inkubation med den cell lysates att möjliggöra upprättandet av interaktioner, biotinylerade betet bunden till dess intracellulära partner dras ned med avidinen eller avidinen derivat konjugerat med stöd pärlor. Sedan, bete-protein interaktioner upptäcks efter tvätt, eluering och analys av denaturering elektrofores följt av Western blot. Ett av problemen med denna teknik är att samspelet mellan proteinet av intresse och dess intracellulära partner pågår utanför ramen för cellulära. Detta är särskilt viktigt för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de sker i specifika intracellulära platser, de är övergående och de utförs vanligtvis av inte riklig proteiner. Därför, inom den cell lysates dessa interaktioner kan maskeras av andra mer riklig proteiner eller av proteiner som vanligen inte är i närheten.
Cell-penetrerande peptider (CPPs) är kort peptider (≤40 aminosyror), består mestadels av katjoniska aminosyror som klarar av att transportera ett brett utbud av molekyler i nästan varje cell3. Laster såsom proteiner, plasmid DNA, siRNA, virus, imaging ombud och olika nanopartiklar har varit konjugerat till CPPs och effektivt internaliserade4,5. På grund av detta transporterar förmåga är de även känd som protein transduktion domäner (PTDs), membran translocating sekvenser (MTSs) och Trojan peptider. Bland CPPs, TAT peptiden från proteinet HIV transactivator TAT6 har varit en av de mest studerade 7,8,9. TAT är en nonapeptide som innehåller 6 Arginin och 2 lysin rester och är följaktligen mycket katjoniska. Substitution studier har visat att den positiva nettoladdningen av TAT är nödvändigt för elektrostatisk interaktioner med plasma membran av eukaryota celler och dess efterföljande internalisering10. Likaså till andra CPPs binder positivt laddade TAT starkt elektrostatiskt till olika negativt laddade arten som finns på extracellulära ytan av cellmembran, inklusive lipid huvud grupper, glykoproteiner och proteoglykaner3 , 10. de bioaktiva laster som transporteras av TAT bli omedelbart gratis i cytosolen att nå deras intracellulära partners.
Här presenterar vi en metod som kombinerar TAT CPP med biotin att studera intracellulära interaktioner. Syftet är att utforma cell-penetrerande beten av fusing den målet biomolecule TAT och biotin. Den största fördelen med detta förslag är att samspelet mellan betet och dess partners kommer att äga rum inom dess cellulära sammanhang. Att visa effekten av denna metod som vi använt som AGN en liten sekvens av proteinet Cx43 som har rapporterats interagera intracellulärt med proto-onkogener c-Src11,12,13. Cx43 är en integrerad membranprotein som uttrycks ofta i astrocyterna14och är ned-reglerade i höggradigt gliom, den vanligaste maligna tumören av centrala nervsystemet15,16,17 ,18. Har man tidigare visat att regionen Cx43 som samverkar med c-Src (aminosyror 266-283 i mänskliga Cx43; PubMed: P17302) smält till TAT (TAT-Cx43266-283) hämmar onkogena aktiviteten av c-Srcin glioma celler och gliom stamceller (GSCs)19,20,21. För att designa den intracellulära beten, Cx43266-283 har smält till TAT vid N-terminalen (TAT-Cx43266-283) och biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283– B). Denna strategi har använts framgångsrikt i den råtta gliom C6 cellinje för att identifiera c-Src, c-terminal-Src kinase (CSK) och fosfatas och Tenzin homolog (PT) som intracellulära partner i denna region i Cx4320. Här, beskriver vi denna metod testar dess effektivitet i mänskliga GSCs, som är mycket relevanta för gliom terapi men mycket svårare att transfect än icke-stammen glioma celler.
Det finns många metoder för att studera protein-protein interaktioner. Metoden presenteras i denna studie bygger på den utbredda biotin-metoden pull-down system där ett biotinylerade bete inkuberas med cell lysates att möjliggöra upprättandet av interaktioner. Ändringen i denna studie innehåller kombinationen av denna teknik med cell-penetrerande sekvenser. Vi föreslår att utforma cell-penetrerande beten som kan inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför de interaktioner som hittade kommer att återspegla de som inträffade inom ramen för cellulära.
Här använder vi TAT som cell-penetrerande sekvens, biotin som taggen nedrullningsbara och regionen av Cx43 mellan aminosyror 266-283 som mål att hitta intracellulära interaktioner i mänskliga GSCs. Den strukturella grunden för samspelet mellan Cx43 och c-Src är välkända11,12. Detta är en viktig interaktion eftersom det hämmar onkogena aktiviteten av c-Src i glioma celler24,13. I själva verket härma CPPs som innehåller denna region (TAT-Cx43266-283) antioncogenic egenskaperna för Cx43 på glioma celler19,20,21. I råtta gliom C6 celler innehåller den mekanism genom vilken hämmar TAT-Cx43266-283 c-Src rekrytering av c-Src tillsammans med dess endogen hämmare CSK och PTEN20. Det bör nämnas att GSCs är mycket intressant som ett mål i gliom terapi, eftersom de utgör en subpopulation som är resistenta mot konventionella behandlingar och därför ansvarig för en upprepning av denna elakartade hjärnan tumörer27. Dessutom de är hård-till-transfect celler och därför studien av intracellulära interaktioner blir svårare. CPPs är snabbt och effektivt internaliseras i GSCs19 gynnar deras användning för studien av intracellulära interaktioner. I denna studie, använder CPPs smält till biotin vi bekräftar samspelet mellan Cx43266-283 sekvensen med c-Src tillsammans med dess endogen hämmare CSK och PTEN i mänskliga GSCs.
Denna metod är mycket kraftfullt att studera den intracellulära verkningsmekanismen bioaktiva föreningar. Det är dock mycket viktigt att bekräfta att den biologiska effekten av biotinylerade cell genomträngande betet inte är annorlunda från som erhålls med den icke-biotinylerade en. Det här steget krävs att associera de interaktioner som hittade med effekten av den bioaktiva föreningen. Dessutom bör stabiliteten i föreningen, dess eventuell nedbrytning av proteaser samt dess möjliga toxicitet, noggrant testade och beaktas innan du planerar experiment. I exemplet presenteras, har anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283 på G166 mänskliga GSCs tidigare dokumenterat20. I denna studie bekräftar vi att anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283– B och av TAT-Cx43266-283 är mycket lik. Dessutom analysen av cellulära morfologi visade att α-tubulin och F-aktin distribution är mycket likartad i G166 GSCs behandlade med TAT-Cx43266-283– B eller med TAT-Cx43266-283. Sammantaget indikerar dessa resultat att införandet av biotin på c-terminus av TAT-Cx43266-283 inte ändra effekterna av denna förening på mänskliga GSCs. Dock om biotin skulle ändra effekterna av bioaktiva molekylen, kan andra taggar för protein rening testas, såsom den flagga octapeptide (DYKDDDDK)28, mänsklig influensa hemagglutinin-derived etiketten HA (YPYDVPDYA) eller glutation S-transferas (GST)29. Likaså om TAT inte är inriktat på cell befolkningen av intresse, andra cell genomträngande sekvenser, såsom penetratin, MPG (för en genomgång, se30) eller cell specifika sekvenser kan vara begagnade31.
Förutom studien proteiner som specifikt samverkar med sekvensen mål, helst bör förekomsten av proteiner som samverkar med både kontrollen och det målet sekvens och proteiner som inte interagerar med dem, som positiva och negativa kontroller, vara upp. I denna mening, Vi hittade Cav-1 i kontrollen och behandlade situationen, vilket tyder på att caveolae har varit inblandade i mekanismen av internalisering, som det har tidigare visats26. Dessutom FAK, som samverkar med c-Src men inte förväntas interagera med Cx43 c-terminalen, var frånvarande i både kontroll och behandlade situationen. Dessa resultat förstärka samspelet mellan TAT-Cx43266-283– B, c-Src, CSK och PTEN specificitet. För att bekräfta de resultat som erhålls med detta protokoll, kan konfokalmikroskopi användas för att visualisera fördelningen av de samverkande proteinerna och studera deras samtidig localization. Således, Vi hittade att TAT-Cx43266-283– B och c-Src uppvisar en liknande intracellulär distribution med några punkter av samtidig localization bekräftar resultaten erhålls med den nedrullningsbara experimenten. I själva verket TAT-Cx43266-283– B sprids nära plasmamembranet vilket tyder på att lastens i denna studie Cx43266-283, dirigerar molekylen till dess intracellulära partner.
En av begränsningarna i den föreslagna metoden är att molekylen används som bete kan misslyckas att vika ordentligt och de förväntade effekterna inte skulle hittas. I den här situationen kunde de interaktioner som hittade inte associeras till effekten. Dock kan denna metod vara särskilt intressant för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de utförs oftast av egensäkra oordnade regioner32 och därför inte kräver en ordnad vikning. En av fördelarna med den föreslagna metoden är dessutom att tidsförloppet för interaktionen kan följas, vilket är särskilt relevant för övergående interaktioner. Relevansen av varje rester på interaktionen kan dessutom studeras enkelt. Det är faktiskt möjligt att studera betydelsen av posttranslationell modifieringar på protein-protein interaktioner, till exempel genom phosphomimetic substitution av glutamat för serine eller treonin. På samma sätt tillåter substitution av serine eller treonin för alanin eller tyrosin för fenylalanin testa effekten av icke-phosphorylatable serine, treonin eller tyrosin.För att efterlikna phospho-tyrosin, är det mest exakta sättet substitution av Tyr för p-Tyr33.
Slutligen, omfattningen av detta protokoll är långt bortom protein-protein interaktioner eftersom detta system kan tillämpas på andra bioaktiva laster såsom RNA sekvenser, nanopartiklar, virus eller andra molekyler som kan smält till biotin och sensorik med CPP att studera deras intracellulära verkningsmekanism.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar M. Morales och J. Bravo för deras hjälp med utformningen av CPPs och J.C. Arévalo för hans hjälp med protokollet nedrullningsbara. Vi är tacksamma för tekniskt bistånd av T. del Rey. Detta arbete stöds av Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spanien; FEDER SA026U16 och Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez och A. González-Sánchez är mottagare av ett stipendium från Junta de Castilla y León och Europeiskasocialfonden.
G166 GSC line | BioRep | ||
RHB-A stem cell medium | Takara | Y40001 | |
Laminin Mouse Protein | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 23017-015 | 10 µg/ml |
B-27 Serum free Supplement (50X) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 2% |
N-2 Supplement (100x) | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 17502-048 | 1% |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/ml |
Recombinant Human b-FGF | Peprotech | AF-100-18B | 20 ng/ml |
PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4 | |||
Accutase | Sigma | A6964 | |
Cryostor CS10 cryopreservation medium | StemCell Technologies | 7930 | |
TAT | GenScript | – | Custom made |
TAT-B | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283 | GenScript | – | Custom made |
TAT-Cx43266-283-B | GenScript | – | Custom made |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A1275737 | 1/20 |
Monoclonal α-tubulin mouse antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | 1/500 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | 1.25 mg/ml | |
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose | ThermoFisher Scientific | 29200 | |
Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA | |||
Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free | Calbiochem, Bionova | 539134 | 1/100 (v/v) |
Sodium Fluoride | PanReac AppliChem | 141675 | 1 mM |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | 1 mM |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | 0.1 mM |
Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . | 1X | ||
Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WR0100 | |
NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | WG1402box | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0001 | 1X |
NuPAGE Transfer Buffer 20x | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | NP0006 | 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB23001 | |
iBlot 2 Dry Blotting System – Gel transfer device | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water | Sigma | P7170 | |
FAK polyclonal rabbit antibody | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | AHO0502 | 1/500 |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Csk polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 4980 | 1/500 |
PTEN polyclonal mouse antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 9552 | 1/500 |
Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody | Abcam | ab2910 | 1/1000 |
Goat anti-mouse IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | Sc-2005 | 1/5000 |
Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody | Quimigen, Santa Cruz Biotechnology | SC-2030 | 1/5000 |
Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 | |
Src polyclonal rabbit antibody | Cell Signalling (WERFEN) | 2108S | 1/500 |
Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | A11029 | 1/1000 |
Cy2-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-220-089 | 1/500 |
MicroChemi Luminescence system | DNA Bio-Imaging Systems | ||
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) | Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific | V13241 | 1/500 |
SlowFade Gold antifade reagent | Life Technologies, ThermoFisher Scientific | S36936 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) | Honeywell | 41641-1L | |
Appliskan 2001 | Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific |