小鼠胚胎心肌内祖群的定量全贴免疫荧光分析
Summary
在这里, 我们描述了一个协议的全贴装免疫荧光和图像定量容积分析早期小鼠胚胎。我们提出这项技术是一个强有力的方法, 定性和定量评估心脏结构在发展过程中, 并提出它可能会广泛适用于其他器官系统。
Abstract
使用不断进步的成像技术, 有助于我们增加对胚胎发育的理解。植入前发育和器官移植是两个领域的研究, 得益于这些进步, 由于数据的高质量, 可以直接从成像前胚胎或活体器官。虽然前胚胎产生的数据具有特别高的空间分辨率, 但后期阶段对三维重建的顺从性较差。为已知的胚胎结构获得高质量的3D 或体积数据, 与命运图或遗传谱系追踪相结合, 可以对发生在胚胎发育过程中的形态发生事件进行更全面的分析。
本议定书描述了一个完整的免疫荧光方法, 允许标记, 可视化, 并定量的祖细胞在发展中的心脏新月, 一个关键的结构在心脏发育过程中形成。这种方法的设计方式是, 可以获得细胞和组织级的信息。利用共焦显微镜和图像处理, 该协议允许三维心脏新月的空间重建, 从而提供了分析特定祖群的定位和组织的能力心脏发育的关键阶段。重要的是, 使用参考抗体可以连续掩蔽心脏新月和随后的定量测量的区域内的新月。本议定书不仅能够对早期心脏发育进行详细的检查, 而且应适用于肠早期节期小鼠胚胎的大多数器官系统。
Introduction
器官发生的研究一直依赖于发育中胚胎的形态发生事件的观察。这些研究往往依赖于使用荧光染料或血统追踪记者与标签的定义参考人口。1通过比较这些标签的相对位置, 可以收集有关某一群体的起源、移动或最终贡献的信息。移植和命运映射实验使用形态学地标或染料射入 non-motile 血统定义兴趣细胞的出发点, 然后被审查为贡献对被开发的胚胎。2,3,4,5遗传谱系跟踪实验使用与定义明确的报告等位基因相同的概念, 用于标记细胞数量, 而无需进行实验操作。这些方法的关键是能够确定, 具有高空间分辨率, 实验和参考标签的位置。这些方法在前发育和外植体研究方面取得了显著进展。6,7,8,9
近年来, 心脏形态发生的发展事件越来越受到人们的广泛描述。10这一研究领域的主要发现之一是描述了一些可以通过独特标记的表达来区分的祖群。11这些种群包括第一和第二个心脏领域 (FHF 和 SHF), 它们存在于胚胎前侧的心脏新月中 (E) 8.25 的小鼠发育。12这些种群经常通过广泛的显微镜的结合进行检查, 这提供了组织级的信息, 并通过免疫荧光分析进行了序列切片, 这提供了高的细胞分辨率, 但two-dimensional 空间信息。13因此, 虽然这些研究大大提高了我们对心脏发育的认识, 但现有的方法在这些阶段对形态发生的深入定量分析有限, 因此需要采取方法来检查这些人口的组织在一个整体有机体水平。
最近的进展, 共焦显微镜和3D 图像分析允许高分辨率和高通量算法重建的细胞和结构原位相对容易, 从而铺平了道路的详细研究复杂细胞结构。14随着计算能力的提高和大数据管理算法的发展, 既需要处理成像数据集大小的指数增长, 现在可以完全自动化分析。15对成像数据集的自动化分析具有无偏见的优点, 但它只与输入数据集的质量一样可靠;因此, 必须在采集和图像预处理过程中使用最佳, 以确保最高质量、无偏见的分析。16协议可以完全自动化并共享以实现重复性, 而专有软件所使用的算法也可通过库来方便地使用, 这些用户熟悉现代专有或开源开发工具。17
下面的协议解释了在心脏发育过程中对一个明确的器官形成模型进行分析的必要步骤。具体来说, 该协议描述了如何 (1) 收获和解剖心脏新月期胚胎, (2) 执行全贴装免疫荧光的参考 (Nkx2-5) 和实验 (Foxa2Cre:YFP18,19) 标记, (3)使用共聚焦显微镜制备和成像胚胎, 最后 (4) 使用先进的三维方法对结果图像进行分析和量化。在这里, 以心脏新月为例, 通过适当的修改, 本协议可用于分析肠早期节期胚胎的多血统。
Protocol
Representative Results
Discussion
上面的协议描述了从高质量的 post-implantation 小鼠胚胎免疫荧光图像中获取定量数据的策略。当正确执行时, 通过这些步骤生成的3D 体积数据可用于胚胎内多个域的比较和交叉分析。表面信号掩蔽方法的描述是特别使用时, 研究新的细胞数量与公认的参考结构比较。
我们认为, 这种方法比现有方法具有明显的优势。全贴装免疫荧光与广域成像可以提供组织级信息, 但缺乏细胞分?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由 NIH/aha R56 HL128646 和 Mindich 儿童健康和发展研究所 (MCHDI) 在 ISMMS (北达科他州) 资助。比由 NIH/NIDCR 培训 T32 HD075735 支持。显微镜和图像分析是在位于西奈山的伊坎医学院的显微镜中心进行的, 这部分由西奈山 P30 CA196521 悌癌症研究所支持。
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
Riferimenti
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
