Этот протокол исследования роли хемокиновых (C-C мотив) лигандом 5 (CCL5) в гипоталамусе, обеспечивая антагонист, встретилCCL5, в мозг мыши, с помощью микро осмотических насосов мозга инфузионные системы. Этот временный ингибирование активности CCL5 прервал гипоталамуса инсулина сигнализации, ведущих к глюкозе и чувствительность периферических системных инсулина.
Инсулин регулирует систематические метаболизм в гипоталамусе и реакции периферической инсулина. Воспалительной реакции в периферических тканях жировой способствует развитию сахарного диабета (T2DM) тип 2 и регуляции аппетита в гипоталамусе. Хемокиновых CCL5 и C-C хемокиновых рецепторов типа 5 уровней (CCR5) было предложено выступить посредником атеросклероз и глюкозы нетерпимость в сахарный диабет типа 2 (T2DM). Кроме того CCL5 играет роль нейроэндокринных в гипоталамусе, регулируя питание потребление тела температуры и, таким образом, побудило нас расследовать его функцию гипоталамо инсулина сигнализации и регулирование метаболизма глюкозы периферийных.
Инфузионные системы микро осмотических насосов мозга является быстрый и точный способ манипулировать CCL5 функции и изучить его действие в головном мозге. Он также предоставляет удобный альтернативный подход к генерации нокаут трансгенных животных. В этой системе CCL5 сигнализации был заблокирован intracerebroventricular (ICV) настой его антагониста, встретилCCL5, с использованием микро осмотических насосов. Деятельность периферийных глюкозы метаболизм и инсулина был обнаружен устный тест толерантности глюкозы (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT). Сигнализации активность инсулина затем был проанализирован белка пятно от образцов тканей, полученных от животных.
После 7-14 дней встретилCCL5 вливания, метаболизм глюкозы и инсулина реагирования был поврежден в мышей, как показано в результатах ТТГ и МТС. Фосфорилирование serine302 IRS-1 был увеличен и активность акт был уменьшен в нейронов гипоталамуса мышей после CCL5 ингибирования. Вообще наши данные показывают, что блокирование CCL5 в мозг мыши повышает фосфорилирование S302 IRS-1 и прерывает гипоталамуса инсулина сигнализации, ведущих к снижению функции инсулина в периферических тканях, а также ухудшение глюкозы метаболизм.
Инсулин влияет широкий спектр тканей, включая мозг. Инсулин проходит через гематоэнцефалический барьер, входит центральной нервной системы (ЦНС) и связывается с рецепторами инсулина (ИК) в гипоталамусе регулировать потребление пищи, симпатической активности и реакции периферической инсулина. Хроническое воспаление в периферических тканях жировой было предложено вносить типа 2 диабет (T2DM), но как эти воспалительные реакции влияют на инсулин сигналов в гипоталамусе посредничать системных инсулина ответ и глюкозы нетерпимость остается неясным. Некоторые chemokines участвуют в регуляции аппетита и регулирование температуры тела в гипоталамусе1 как фактор некроза опухоли альфа (TNFα), интерлейкина -6, ИЛ 1β, (IL) Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) и CCL5 (C-C мотив лигандом 5 ). Кроме того воспаление в гипоталамусе приводит к резистентности к инсулину в T2DM2,3.
Среди этих chemokines, изменения уровни выражения хемокиновых CCL5 и его рецептор CCR5, в жировых тканях был связан с атеросклерозом и глюкозы нетерпимость в T2DM людей, а также животных. CCL5 также имеет нейроэндокринной функции, включая регулирование всасывания и тела температуры пищи, в гипоталамусе. Поэтому важно расследовать ли CCL5 участвует в активации сигнала инсулина в гипоталамусе или периферических тканях.
Инсулин сигнализации жестко регулируется в пределах ячейки. Связывание инсулина в инсулиновых рецепторов (IR) активирует инсулина рецептор белков субстрата (IRS), следуют фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и протеин киназы B (PKB/AKT) активации и глюкозы транспортер-4 (GLUT4) мембраны транслокации4 . IRS белки являются ключевые регуляторы в этом сигнальный путь: они имеют несколько остатков тирозина и серина, которые могут быть фосфорилированных в ответ на позитивные или негативные инсулина сигналов5. К примеру фосфорилирование Серина 302 на IRS-1 могут привести к физической разобщенностью IRS-1 от ИК и блокировать инсулина сигнальной трансдукции, ведущих к инсулин сопротивление6. Было показано, что активность обесценения IRS белков в гипоталамусе побудить сопротивление инсулина и глюкозы нетерпимость в мышей7.
Один распространенный способ для изучения функции определенного гена является обработка экспрессии генов-мишеней распределены по всему телу организма. Однако, это может иметь несколько недостатков: 1) он может генерировать регулирования или компенсационные эффекты различных обратной связи со временем и 2) Этот метод не поможет нам проиллюстрировать роль целевого белка в регионах конкретных мозга. Кроме того животные Нокаут гена конкретных тканей и клеток занять много времени, чтобы породы и дорогостоящим. Таким образом мы используем краткосрочных мозга инфузионные системы осмотических насосов – относительно быстрый и удобный способ вмешиваться с сигнализацией целевого белка в головном мозге, используя антагонист наркотиков для преодоления вышеупомянутых вопросов. Стереотаксическая инъекции для требуют сложных хирургических навыков и обширные инвестиции в оборудование и время. В этом протоколе мы предоставляем простой и безопасный способ выполнения стереотаксической инъекций и быстрый, менее вредных и мгновенной метод определения концентрации глюкозы в крови и расследовать роль CCL5 в гипоталамо инсулина, сигнализации регулирования.
Механизма хронического воспаления и смежных chemokines как CCL5 и его рецептор-CCR5 в развитии диабета 2 типа остается неясным. Хроническое воспаление вызывает проникновение макрофагов в жировых тканях и влияет на регулирование адипокинов; в то же время она также привлекает β-клеток и препятствует секреции инсулина из островков Лангерганса в ответ на уровень глюкозы в крови. Гипоталамуса в мозге играет важную роль в качестве центра управления в координации инсулина и АдипоКин сигналы от системного периферических тканей в регулировании аппетита, периферической крови метаболизма глюкозы и инсулина ответ. Многие исследования также указывают, что гипоталамуса воспаление приводит к дефектных регулировании энергетического гомеостаза, а также дефектные поджелудочной островок функции печени2,3,9,10. CCL5 в мозге способствует питание потребление и тела регулирования температуры в гипоталамусе11,12; Однако неясно соотношение CCL5 к сигнализации гипоталамуса и системных инсулина. CCL5 всего тела нокаут мышь (CCL5– / –) был создан для решения этого вопроса, который показывает фенотип сопротивление инсулина с более высокие уровни инсулина и уровень глюкозы в крови в крови8. Однако он требует много времени, чтобы развивать T2DM фенотип и трудно расследовать роль и механизм CCL5 сигнала гипоталамуса инсулина из-за возможных долгосрочных компенсационных эффектов. Таким образом прямое манипулирование CCL5 сигнализации в нейронов гипоталамуса является лучшим подходом. Однако, есть несколько типов нейронов гипоталамуса региона, и это довольно дорогим и трудоемким для генерации клеток конкретных нокаут мышей. Используя ICV инфузионные системы может таким образом сэкономить время и обеспечить более конкретный подход для манипулирования CCL5 функции непосредственно в мозг, обходя возможные периферические воспалительные реакции.
Исследования с использованием осмотических насосов уже были опубликованы ранее, предоставляя большие примеры и демонстрации методов участвующих в имплантации осмотических насосов в грызунов13. Однако мы столкнулись с несколько задач, соблюдая эти протоколы в нашем исследовании. Во-первых некоторые из оборудования, используемого в протоколе довольно дорого, в том числе 1 электрические системы для достижения местоположения, рисование и вставляя иглу в мозг мыши, 2) Термо система для поддержания температуры тела мыши и 3 кислорода изофлюрановая Поставка системы администрирования анестезии для мышей. Во-вторых методы, описанные в других статьях были трудно повторить, потому что мы смогли только использовать животных в пределах небольшой диапазон веса тела и в некоторых возрастных группах для нашего исследования. Мы осознаем, что больше мышей больше подходят для хирургии и имплантации. Однако, в нашем исследовании, мы должны были использовать меньшие и более молодых мышей, чтобы избежать избыточного веса и эффекты старения на инсулин и крови глюкозы регулирования: только самцов мышей с телом вес 25 ± 2 g и возраст около 2 месяцев были выбраны в исследовании. Таким образом трудно выполнить операцию и шовные рану на голове мыши. В-третьих воспалительный процесс должен сворачиваться после операции, поскольку воспалительных цитокинов является мишенью в этом исследовании. Мышей и крыс можно удалить шов и легко открыть раны после операции, которая приведет к воспаления и увеличить хемокиновых реакций. Следовательно необходима стратегия достижения местоположение и рисовать и вставить иглу в мозг мыши, что позволяет избежать вторичной инфекции. Таким образом мы изменили ранее описанные протоколы, чтобы сделать этот метод экономически эффективным, легче и менее вредны для животных, как описано в следующем пункте.
Во-первых мы использовали ногтей дрель вручную просверлить отверстие вокруг целевой области, отмеченные на череп, как описано в пункте 2.6. Этот метод является экономически эффективным и позволяет нам контролировать всю процедуру таким образом, чтобы избежать повреждения мозговых оболочек мыши и кровеносных сосудов. Регулирование глюкозы крови ухудшается после острого инсульта, например кровоизлияния в мозг. Острой гипергликемии и диабет как синдромы также наблюдались после инсульта в клинических параметров14,15. Аналогичным образом мы также нашли зрением глюкозы уровня и инсулина ответ у мышей с кровотечением и гной в головном мозге. Мы осознаем, что лучшего контроля на основе ручной хирургии является необходимым для обеспечения согласованности результатов. Во-вторых мы воспользовались недавно разработанные медицинские биоматериала обычно используется в клиниках, ткань клей клей (шаг 2.8), для уплотнения кожи на голове мыши после хирургии, следовательно, избегая швов и ускорению заживления. Это упрощает хирургических процедур для выполнения и уменьшает вероятность вторичного воспаления. В-третьих время, необходимое для выполнения всей хирургическая процедура сравнительно короче, которая увеличивает шансы на выживание для мышей и снижает дозировку обезболивающий препарат, будучи вводили внутрибрюшинно. Мы отметил высокую выживаемость (95%) и получено после этого измененного Протокола относительно точные результаты.
Ограничением этой методики является сравнительно короткие сроки доставки лекарств. Хотя альтернативно осмотических насосов могут быть помещены в тело мыши без повторного открытия мозга, наше исследование только сосредоточена на воспалительные хемокиновых воздействие на мозг регулировать сигнализации периферийных системных инсулина. Дополнительные операции в периферических тканях возможно может вызвать воспалительные реакции в периферических тканях, которые бы затем увеличить экспрессия хемокиновых воспалительных и повлиять на результаты. Во-вторых период полувыведения препарата также ограничивает продолжительность исследования. Рекомбинантных белков например хемокиновых обычно имеют более короткий период полураспада, который теряет свою деятельность с течением времени, хотя это также позволяет нам изучить эффект блокировки CCL5 сигналов в головном мозге в краткосрочной перспективе. Наши предыдущие исследования также описал подход генетической модификации для генерации CCL5 нокаут мышь, которая предоставляет модель с долгосрочные эффекты8.
Есть некоторые новые методы и альтернативные методы для доставки наркотиков в мозг. Нанотехнологии – это мощный метод, который может использоваться для доставки наркотиков в центральной нервной системе. Однако многие препараты являются термочувствительных и могут быть уничтожены при попытке упаковать их в наночастиц16. Кроме того наночастицы могут пройти через BBB и быть освоен клетками, которые подходят для малых интерферирующих РНК или наиболее распространенных лекарств, но это не идеальный метод для привязки рецептор лиганд.CCL5 требует привязки к его рецептор CCR5, в ARC нейронов гипоталамуса принять эффект8, и доставки CCL5 антагонист CCL5 встретилсяв нейроны через наночастиц может привести к потере способности связывать и заблокировать CCR5 на ячейку поверхности.
Уровень глюкозы в крови был значительно выше у мышей, управляемых с CCL5-антагонист встретилCCL5 сравнению с элементами управления (мышей с фаго) в тест на переносимость глюкозы устные. Дополнительные инсулина администрации (тест толерантности инсулина) также смогла снизить уровень глюкозы в крови в MetCCL5 получения мышей (рис. 4B), что свидетельствует о том, что как внутреннего, так и внешние инсулин не может снизить уровень глюкозы в крови При блокировании гипоталамуса CCL5 сигнализации. Мышей стали устойчивыми инсулина без CCL5 активности в гипоталамусе. Увеличение serine302 фосфорилирования IRS-1 был найден в мышей, получающих Met-CCL5 по сравнению с управления мышей, получающих Фаго (Рисунок 5A-B). Фосфорилирование Серина 302 IRS-1 было показано, чтобы побудить физических диссоциации IRS-1 от рецепторов инсулина, который является одной из основных причин инсулин сопротивление6; инсулин не может активировать течению сигналов, таких как PI3K-Akt пути. Ex vivo исследования стимуляции инсулина подтвердил инсулина, которые ниже по течению сигнальной молекулы Akt (p-AktS473) не был активирован инсулина в гипоталамо ткани мыши infused с Met-CCL5 и, вместо этого, фосфорилирование Серина 302 увеличилось. В целом физиологических данных (ТТГ и ITT) и молекулярные исследования демонстрируют, что гипоталамуса CCL5 сигнализации опосредует регулирования сигнала гипоталамуса инсулина, который способствует систематической инсулин сопротивление и глюкозы метаболизма.
Роль и механизм CCL5 и CCR5 в связанных с ожирением диабетом остается неясным. Kitade et al. сообщили, что CCR5 дефицит защищенных мышей от ожирения индуцированной воспаления, макрофагов вербовки и инсулин сопротивление17. Однако другие исследования Кеннеди et al. найти противоположные результаты, указав, что CCR5 дефицит ухудшает системных глюкозе, а также Адипоцит и мышцы инсулина, сигнализации18. Оба исследования применяется высоким содержанием жиров диеты, чтобы вызвать ожирение, что приводит к хроническому воспалению всего тела и компенсаторные реакции. Эти исследования не представила чистые и ясные механизмы CCL5 и CCR5 в инсулине, сигнализации регулирования. С другой стороны метод осмотических насосов позволяет мозга конкретные инфузии и избегает компенсаторные реакции с ее ограниченное по времени доставки.
В заключение, хотя осмотического насос с мозга инфузионные системы, как представляется, «старомодным» техника, он обеспечить дешевле, проще и менее вредными метод доставки лекарств и помогает исследовать функцию лиганд-рецепторов сигналов в мозг.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны поддерживаемых от министерства науки и технологии, Тайвань – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) и здравоохранения и социального обеспечения за дополнительную плату табачных изделий – MOHW106-TDU-B-212-144001 с S-Y.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |