Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция
Summary
Этот протокол описывает метод для наблюдения в реальном времени зеленый флуоресценции белков (ГПУП) меткой 4 транспортера глюкозы (GLUT4) белки людьми после стимуляции инсулина и характеристика биологической роли CCR5 в инсулин GLUT4 сигнальный путь с деконволюция микроскопии.
Abstract
Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения, который характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамуса в центральной нервной системе (ЦНС) является центром управления для энергетики и инсулин сигнал ответа регулирования. Хроническое воспаление в периферических тканях и диспропорций в некоторых chemokines (например, CCL5, TNFα и IL-6) способствуют диабета и ожирения. Однако функциональные механизм(ы) соединения chemokines и гипоталамо инсулин сигнал регулирование по-прежнему остаются неясными.
В vitro первичный нейрон культуры модели являются удобной и простой модели, которые могут быть использованы для изучения инсулин сигнал регулирования в нейронов гипоталамуса. В этом исследовании мы внедрили периферийной GLUT4 белка с GFP (GFP-GLUT4) в первичных нейронов гипоталамуса отслеживать GLUT4 мембраны транслокации после стимуляции инсулина. Промежуток времени изображения оборота белка GFP-GLUT4 были записаны деконволюция микроскопии, что позволило пользователям создавать высокоскоростной, с высоким разрешением изображения без повреждения нейронов значительно во время проведения эксперимента. В CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса, которые были изолированы и культивировали от CCR5 нокаут мышей наблюдалось вклад CCR5 в инсулин регулируется GLUT4 транслокации. Наши результаты показывают, что эффективность транслокации мембраны GLUT4 был уменьшен в CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина.
Introduction
Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения. T2DM характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамус является центр управления, который регулирует энергетического гомеостаза организма, аппетит и циркадные ритмы. Самое главное гипоталамус также посредником инсулин сигнал реагировать регулировать системного метаболизма1,2,3,4,5. Нарушая гипоталамуса инсулина сигнализации, путь может индуцировать инсулин сопротивление6,7. Гипоталамус координирует клеточной энергии статус и секреции гормонов, таких как инсулин и адипокинов (например, лептин) от периферических тканей, регулируют метаболизм системных глюкозы, инсулина быстродействие и приема пищи. Инсулин связывание с рецепторами инсулина активирует рецепторов инсулина субстрата (IRS) белков, которые затем активировать инсулина течению сигнальных молекул, таких как PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы) и AKT (протеинкиназы B (PKB/AKT)), чтобы побудить GLUT4 транслокации мембраны. Нейроны не являются основной мишенью для поглощение глюкозы в ответ инсулина; Однако значительные уровни выражения GLUT4 были определены в регионе гипоталамуса дугообразном ядре (ARC). Таким образом регулирование GLUT4 в нейронов гипоталамуса могут играть важную роль в инсулине сигналов в мозг периферической оси.
Многие исследования показали, что хроническое воспаление и воспалительные chemokines в гипоталамусе также играют важную роль в развитии диабета и ожирения, и подавление гипоталамо воспаления может обратить вспять диета индуцированного инсулина сопротивления 8 , 9 , 10. Кроме того, хемокиновых CCL5 (C-C мотив лигандом 5, также известный как RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) и его рецептор CCR5 уровнях также коррелирует с развитием T2DM11,12. Роли CCL5 и CCR5 в функции и глюкозы метаболизм инсулина остаются неясными. Одно исследование сообщало, что CCR5 дефицит защищенных мышей от ожирения индуцированной воспаления, макрофагов вербовки и инсулин сопротивление11; в отличие от другого исследования сообщили, что CCR5 дефицит ухудшает системных глюкозе, а также Адипоцит и мышцы инсулина, сигнализации12. CCL5 найдена увеличить поглощение глюкозы в Т-клеток и уменьшить потребление пищи через свои действия на гипоталамус13,14, однако, механизм действия и рецепторов, участвующих еще должны быть определены.
Это трудно изучение клеточных механизмов, лежащих в основе эффект воспаление периферических тканей на инсулин, функционирующих в нейронов гипоталамуса. Это по соображениям сотовой неоднородность и нейрон цепь обратной связи. По этой причине в пробирке модель культуры клеток обеспечивает чистую модель для изучения последствий хемокиновых гипоталамуса инсулин сигнал регулирования. Хотя есть много установленных увековечен гипоталамуса нейрональных клеточных линий для использования в исследовательских целях, эти клеточные линии выразили различные маркеры и поэтому представляют собой различные типы нейронов гипоталамуса15. Хотя основной гипоталамуса культур может быть трудно поддерживать, они могут обеспечить наиболее реалистичный ответ нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина и можно также избежать возможных неизвестные эффекты, которые приходят в играть при поддержании клеток Долгосрочный в питательной среды с искусственных факторов роста.
Здесь мы используем первичной нейронов гипоталамуса C57BL/6 wildtype (WT) мыши и CCR5 нокаут (CCR5– / –) Мышь и transfect обоих типов клеток с GFP-GLUT4 конструкции. Расследовать CCR5 вклад инсулина при посредничестве GLUT4 мембраны людьми, GFP-GLUT4 transfected нейронов относились с инсулина или рекомбинантным CCL5. Мы затем характеризуют движение GFP-GLUT4 на плазматической мембране в первичной нейронов гипоталамуса с деконволюция микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность контролировать живых клеток, при CCL5 или инсулин стимуляции, является критически важным для изучения быстрого эффекта CCL5 или инсулина на GLUT4 движения. В самом деле это позволяет нам визуализировать существенное различие между WT и CCR5– / – нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина. Мы выполнили поверхности маркировки эндогенного белка GLUT4 в WT и CCR5– / – нейронов гипоталамуса в разное время точках после инсулина стимуляции17. Маркировки белков клеток поверхности требует высокой специфичности антитела с низким фоном. Кроме того поверхности флуоресценции количественной оценки также может быть сложным и трудоемким. Таким образом покадровой записи позволяет нам быть уверены, что эффект CCL5 или инсулин является истинной физиологических изменений, основанных на экспериментальных условиях, вместо того, чтобы статистические вариации. Вместе с поверхности маркировки эндогенного GLUT4, мы предоставляем убедительные доказательства и экспериментов, чтобы продемонстрировать, как CCL5 и CCR5 участвуют в GLUT4 транслокации и инсулина сигнализации.
В современной клеточной биологии и молекулярной биологии исследования многие эксперименты требуют использования микроскопии флуоресцирования. Эта технология позволяет ученым для визуализации пространственных отношений между белков и/или клеточных органелл, помимо направления движения и скорости, стимулирующее воздействие, морфологические изменения и белка людьми. Однако, эта технология по-прежнему имеет свои ограничения: при возбуждении флуорофоров, сигналов от целевого белка (или области) может быть перегружены фон флуоресценции. В результате флуоресценции изображения можно размытым с ожидаемой сигналов, похоронены глубоко в фон сигналов. Это явление особенно очевидна для наблюдения за мембраны прыгните белков.
Общая микроскопии флуоресцирования внутреннего отражения (TIRFM) была разработана для преодоления этой трудности. Это позволяет ученым представить возбуждения отдельных привязанных к поверхности флуорофоров, не затрагивая фон флуорофоров. Это позволяет ученым выборочно охарактеризовать функции и события на очень тонкой поверхности региона например плазматической мембраны. Деконволюция микроскопии-образ интенсивных вычислений, обработки технику, что стало возможным с помощью технологических достижений за последние годы. Он часто использовались для улучшения разрешения изображения цифровой флуоресценции. Как упоминалось ранее, когда флуорофоров возбуждаются любые виды освещения (например, лазерные и светодиодные), все флуорофоров будет излучать световые сигналы независимо от если они находятся в центре внимания или нет, поэтому изображение всегда будет размытым. Это размывание вызвано явление под названием «Точка распространения функция» (ФСФ), как свет приходя от источника небольшой флуоресцентные (яркое пятно) будет распространяться дальше и стать не в фокусе (размытие). В принципе это событие будет производить Песочные часы как формы флуоресцентного сигнала, и образ флуоресценции может состоять из многочисленных такие световые сигналы. Деконволюция процесс может переназначить все сигналы флуоресценции к своей первоначальной форме яркие пятна и устранить большинство из фокус света улучшить контрастность изображения.
В последние годы деконволюция алгоритмы создают изображения с сопоставимыми резолюции что конфокального микроскопа. Кроме того по сравнению с TIRFM, который предотвращает размытие вне фокуса будучи обнаруженным ограниченной возбуждения региона,-поля микроскопии позволяет всем свет сигналы, чтобы быть обнаружены и переназначает их обратно к их источнику через процесс деконволюции. Таким образом на практике, деконволюции микроскопии стала не только более эффективный метод получения изображения, но и более эффективный метод по сравнению с TIRF микроскопии.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за субсидии, предоставленные Министерством науки и технологии, Тайвань – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) и здравоохранения и социального обеспечения за дополнительную плату табачных изделий – MOHW106-TDU-B-212-144001 с S-Y.
Materials
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
Riferimenti
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?. J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism – from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis?. Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
