صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution
Summary
هذا البروتوكول وصف تقنية للمراقبة في الوقت الحقيقي الأخضر Fluorescence البروتين (بروتينات فلورية خضراء) معلم البروتين الجلوكوز الناقل 4 (GLUT4) الاتجار بالأشخاص على تحفيز الأنسولين وتوصيف دور CCR5 البيولوجية في الأنسولين – GLUT4 يشير إلى مسار مع Deconvolution مجهرية.
Abstract
نوع 2 داء السكري (T2DM) هو أزمة صحية عالمية التي تتميز بالانسولين مما يشير إلى ضعف والتهاب مزمن في الأنسجة المحيطية. تحت المهاد في الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو مركز التحكم للطاقة، والإنسولين إشارة استجابة النظام. التهاب مزمن في الأنسجة المحيطية والاختلالات من المستقطبات معينة (مثل CCL5، TNFα، وايل-6) المساهمة في مرض السكري والسمنة. ومع ذلك، أن الآليات الوظيفية يربط بين المستقطبات والإنسولين طائي إشارة التنظيم لا تزال لا تزال غير واضحة.
في المختبر العصبية الأولية ثقافة النماذج هي نماذج بسيطة ومريحة التي يمكن استخدامها للتحقيق في لائحة إشارة الأنسولين في الخلايا العصبية طائي. في هذه الدراسة، أدرجنا اكسوجينيوس GLUT4 البروتين مترافق مع التجارة والنقل (بروتينات فلورية خضراء-GLUT4) في الخلايا العصبية طائي الأولية لتعقب GLUT4 غشاء إزفاء إلى تحفيز الأنسولين. الوقت الفاصل بين الصور للتجارة والنقل-GLUT4 البروتين الاتجار سجلت deconvolution المجهري، مما يسمح للمستخدمين لتوليد صور عالية الجودة والسرعة دون إتلاف الخلايا العصبية إلى حد كبير أثناء إجراء التجربة. ولوحظ مساهمة CCR5 في الأنسولين وينظم GLUT4 إزفاء في CCR5 ناقصة طائي الخلايا العصبية، التي كانت معزولة ومثقف من الفئران خروج المغلوب CCR5. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن خفض كفاءة إزفاء غشاء GLUT4 في الخلايا العصبية طائي ناقص CCR5 بعد تحفيز الأنسولين.
Introduction
نوع 2 داء السكري (T2DM) أزمة صحية عالمية. وتتميز T2DM بالانسولين مما يشير إلى ضعف والتهاب مزمن في الأنسجة المحيطية. تحت المهاد هو مركز التحكم الذي ينظم التوازن الطاقة في الجسم والشهية وايقاعات سيركاديان. الأهم من ذلك، تحت المهاد أيضا يتوسط الأنسولين إشارة استجابة لتنظيم الأيض النظامية1،2،3،،من45. تعطيل الأنسولين طائي مما يشير إلى مسار يمكن أن تحفز الأنسولين المقاومة6،7. تحت المهاد ينسق مركز الطاقة الخلوية وإفراز الهرمونات، مثل الأنسولين وأديبوكينيس (مثلاً، اللبتين) من الأنسجة المحيطية، تنظيم استقلاب الجلوكوز النظمية، واستجابة الأنسولين، وتناول الطعام. ينشط الأنسولين ملزمة لمستقبلات الأنسولين الأنسولين مستقبلات الركازة (IRS) البروتينات، وقم بتنشيط جزيئات الأنسولين مما يشير إلى المصب، مثل PI3K (فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز) وعكة (بروتين كيناز ب (حزب/AKT))، لحمل GLUT4 إزفاء الغشاء. الخلايا العصبية ليست هدفا رئيسيا لامتصاص الجلوكوز في الاستجابة للأنسولين؛ ومع ذلك، قد حددت مستويات كبيرة من التعبير GLUT4 في منطقة طائي arcuate نواة (ARC). ولذلك، تنظيم GLUT4 في الخلايا العصبية طائي قد تلعب دوراً مهما في الأنسولين إشارات في محور الدماغ-الطرفية.
اقترحت العديد من الدراسات أن التهاب مزمن والتهاب المستقطبات في تحت المهاد أيضا دوراً هاما في تطوير مرض السكري والسمنة، وتثبيط الالتهاب طائي يمكن عكس مقاومة الأنسولين الناجمة عن النظام الغذائي 8 , 9 , 10-وعلاوة على ذلك، تشيموكيني-CCL5 (ج-C الحافز يجند 5، يعرف أيضا باسم رنتيس، ريجولاتيدوناكتيفاتيوننورمالتسيليكسبريسيداندسيكريتيد) ومستويات مستقبلات CCR5 ترتبط أيضا بتطوير T2DM11،12. أدوار CCL5 و CCR5 في الأيض وظيفة والجلوكوز الأنسولين لا تزال غير واضحة. أفادت إحدى الدراسات أن نقص CCR5 حماية الفئران من الالتهابات الناجمة عن السمنة والتوظيف بلعم الأنسولين المقاومة11؛ وفي المقابل، أفادت دراسة أخرى أن نقص CCR5 يضعف تحمل الجلوكوز النظامية، فضلا عن الأنسولين adipocyte والعضلات مما يشير إلى12. تم العثور على CCL5 لزيادة امتصاص الجلوكوز في خلايا تي ولتقليل تناول الطعام من خلال عملها في تحت المهاد13،14، غير أن إليه العمل والمستقبلات المعنية لم يتم بعد تحديد.
من الصعب دراسة الآليات الخلوية الكامنة وراء تأثير التهاب الأنسجة الطرفية على الأنسولين في الخلايا العصبية طائي. هذا سبب الأنظمة ردود فعل الدوائر عدم التجانس والعصبية الخلوية. ولهذا السبب، نموذج ثقافة خلايا في المختبر نموذجا نظيفة للتحقيق في آثار تشيموكيني على الأنسولين طائي إشارة التنظيم. على الرغم من أن هناك العديد من إنشاء خطوط الخلايا العصبية طائي مخلدة لاستخدام البحث، هذه خطوط الخلايا علامات مختلفة وأعرب عن، وتمثل بالتالي، أنواع مختلفة من الخلايا العصبية طائي15. على الرغم من أن الثقافات طائي الأولية يمكن أن تكون صعبة للحفاظ على، يمكن توفير الاستجابة الأكثر واقعية للخلايا العصبية طائي على تحفيز الأنسولين، ويمكن أيضا تجنب احتمال تأثيرات غير معروف التي تأتي في اللعب عندما الحفاظ على الخلايا الأجل المتوسط والثقافة مع عوامل النمو الصناعي.
هنا، علينا الاستفادة من الخلايا العصبية طائي الأولية من الماوس wildtype (WT) C57BL/6 وخروج المغلوب CCR5 (CCR5-/-) الماوس، وترانسفيكت كلا النوعين من الخلايا التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 بناء. للتحقيق في مساهمة CCR5 GLUT4 الأنسولين بوساطة غشاء الاتجار، يعاملون بروتينات فلورية خضراء-GLUT4 transfected الخلايا العصبية مع الأنسولين أو CCL5 المؤتلف. ثم أننا تميز حركة التجارة والنقل-GLUT4 في غشاء البلازما في الخلايا العصبية طائي الأولية مع Deconvolution مجهرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على رصد الخلايا الحية، على تحفيز CCL5 أو الأنسولين، من الأهمية بمكان لدراسة تأثير CCL5 أو الأنسولين السريع على حركة GLUT4. في الواقع، فإنه يسمح لنا بتصور الفرق الكبير بين WT و CCR5-/- طائي الخلايا العصبية على تحفيز الأنسولين. ونحن قد أدوا العلامات السطحية للذاتية GLUT4 البروتين في وزن و CCR5-/- طائي الخلايا العصبية في نقاط زمنية مختلفة بعد تحفيز الأنسولين17. تسمية الخلية البروتينات السطحية يتطلب جسم خصوصية عالية مع خلفية منخفضة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن القياس الكمي fluorescence السطحية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وهكذا، يسمح لنا أن نكون على يقين من أن تسجيل الوقت الفاصل بين تأثير CCL5 أو الأنسولين تغيير حقيقي فسيولوجية على أساس الظروف التجريبية، بدلاً من اختلاف الإحصائي. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات السطحية من GLUT4 الذاتية، نحن نقدم أدلة قوية وتجارب لإثبات كيفية المشاركة CCL5 و CCR5 في إزفاء GLUT4 وإشارات الأنسولين.
وفي دراسات البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية الحديثة تتطلب العديد من التجارب استخدام مجهر الأسفار. وتسمح هذه التكنولوجيا العلماء تصور العلاقة المكانية بين البروتينات و/أو العضيات الخلوية، بالإضافة إلى اتجاه الحركة والسرعة وآثار تنشيطية، التغييرات الشكلية، والاتجار بالبروتين. بيد أن هذه التكنولوجيا لا تزال بقصره: عندما تكون متحمس fluorophores، الإشارات المنبعثة من البروتين المستهدفة (أو المجال) يمكن أن تطغى عليها الأسفار الخلفية. كنتيجة لذلك، يمكن أن تظهر الصور fluorescence ضبابية مع إشارات المتوقعة دفنها عميقا في الإشارات الخلفية. هذه الظاهرة جليا على وجه الخصوص للمراقبة للبروتينات الغشاء زمنياً.
مجموع الداخلية انعكاس Fluorescence مجهرية (تيرفم) وضعت للتغلب على هذه الصعوبة. أنها تسمح للعلماء لتصور الإثارة من المحدد زمنياً على سطح فلوروفوريس دون أن يؤثر ذلك فلوروفوريس الخلفية. أنها تسمح للعلماء بصورة انتقائية تميز السمات والأحداث في منطقة سطحية رقيقة جداً مثل غشاء البلازما. Deconvolution المجهري هو صورة مكثفة حسابياً تجهيز الأسلوب الذي أصبح ممكناً بفضل التقدم التكنولوجي في السنوات الأخيرة. كثيرا ما استخدمت لتحسين دقة الصورة الرقمية الأسفار. كما ذكر سابقا، عندما يجري fluorophores متحمسون بأي نوع من الإضاءة (مثل الليزر أو LED)، فلوروفوريس جميع سوف تنبعث منها إشارات المرور الضوئية بغض النظر إذا كانوا في التركيز أو لا، حيث تظهر دائماً الصورة ضبابية. هذا التمويه بسبب ظاهرة تسمى “نقطة نشر الدالة” (PSF)، كما سوف تنتشر كذلك الضوء القادمة من مصدر فلورسنت صغيرة (المضيئة) وتصبح خارج نطاق التركيز (طمس). من حيث المبدأ، هذا الحدث سوف تنتج إشارة مضيئة على شكل يشبه الساعة الرملية، ويمكن أن تتكون صورة الأسفار العديدة مثل هذه الإشارات الخفيفة. عملية deconvolution يمكن إعادة تعيين كافة إشارات الأسفار إلى شكلها الأصلي بقعة مشرقة، والقضاء على معظم الضوء خارج نطاق التركيز لتحسين تباين الصورة.
في السنوات الأخيرة، أدت خوارزميات deconvolution الصور مع قرار مماثل للمجهر [كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع تيرفم، مما يمنع طمس خارج نطاق التركيز من أن يتم اكتشافها بمنطقة محدودة إثارة، مجهرية واسع المجال يسمح لكل ضوء إشارات للكشف عنها ويعيد تعيين لهم العودة إلى مصدرها من خلال عملية deconvolution. ولذلك، أصبح deconvolution المجهري في الممارسة العملية، ليس فقط طريقة الحصول على صورة أكثر كفاءة، ولكن أيضا طريقة أكثر فعالية من حيث تكلفة بالمقارنة مع TIRF المجهري.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان-إضافي MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) والصحة والرعاية الاجتماعية من منتجات التبغ-MOHW106-TDU-ب-212-144001 ص S c.
Materials
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
Riferimenti
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?. J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism – from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis?. Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
