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Neuroscienze

Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56404
, , ,
1Department of Neuroscience,Novartis Institutes for BioMedical Research, 2Stanley Center for Psychiatric Research,Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology and Harvard Stem Cell Institute,Harvard University

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica usata per modellare l’infezione del virus di Zika di sviluppo del cervello umano. Utilizzando wildtype o linee di cellule staminali ingegnerizzati, i ricercatori possono utilizzare questa tecnica per scoprire i vari meccanismi o trattamenti che possono influenzare l’infezione iniziale del cervello e conseguente microcefalia in embrioni di Zika infettati da virus.

Abstract

Il recente emergere di Zika virus (ZIKV) in popolazioni suscettibili ha portato ad un aumento brusco della microcefalia e altre condizioni di neurodevelopmental nei neonati. Mentre le zanzare sono la principale via di trasmissione virale, ha anche dimostrato a diffondere attraverso il contatto sessuale e trasmissione verticale madre-di-feto. In quest’ultimo caso della trasmissione, a causa del tropismo virale unico di ZIKV, il virus si crede principalmente bersaglio le cellule progenitrici neurali (NPC) di sviluppo del cervello.

Qui un metodo per la modellazione di infezione ZIKV e la conseguente microcefalia, che si verificano quando organoids cerebrale umana sono esposti per vivere ZIKV è descritto. Il organoids visualizzare livelli elevati del virus all’interno della loro popolazione di cellule progenitrici neurali e severa delle cellule morte e microcefalia per mostre nel corso del tempo. Questo modello tridimensionale organoid cerebrale permette ai ricercatori di condurre esperimenti di specie-abbinati per osservare e potenzialmente intervenire con l’infezione di ZIKV di sviluppo del cervello umano. Il modello fornisce maggiore rilevanza rispetto ai metodi standard bidimensionali e contiene umani specifici architettura cellulare e l’espressione della proteina che non sono possibili nei modelli animali.

Introduction

Zika virus (ZIKV) has rapidly spread in Micronesia, French Polynesia, and the Americas, and has recently been shown to cross the placental barrier1,2 to infect the developing fetal brain, leading to neurodevelopmental diseases such as microcephaly3,4,5,6 . The long-term impact on these patients' lives, and the current lack of treatment, has led researchers and clinicians to scramble for a better understanding of the mechanisms behind ZIKV infection and replication. Previous studies have examined ZIKV infection of in vitro systems in a variety of physiologically-relevant cell types7,8,9, as well as in vivo10 with immunocompetent and immunocompromised mice11,12,13 and non-human primates14,15,16. In addition to these more conventional techniques, several groups have implemented stem cell-derived cerebral organoids to understand more about ZIKV infection of the developing human brain. These groups have utilized human cerebral organoids to confirm the microcephaly phenotype17,18, investigate receptors linked to virus entry19, examine physiological responses to infection20,21, and potentially screen for drug candidates22. Here a technique for rapidly producing and infecting stem-cell derived cerebral organoids is described, as shown previously19, to improve the understanding of ZIKV infection of the developing human brain.

Since the organoids are formed from standard pluripotent stem cell (PSC) cultures, this technique allows for a variety of scientific questions to be answered regarding viral infection of the developing brain. For example, CRISPR engineering may be used to modify these PSC lines prior to organoid infection at a faster rate than most in vivo genetic studies19. Additionally, unlike in standard two dimensional (2D) differentiation cultures, organoids exhibit the complex cellular architecture that is critical for corticogenesis, and recent studies have shown that this architecture may be disrupted upon infection21.Finally, the relatively low cost of generating organoids allows for higher throughput experimentation and screening when compared to in vivo models. On the other hand, there are some disadvantages to the utilization of organoids to study ZIKV. While organoids are far more biologically relevant than 2D cultures, there are additional challenges in the assessment of organoids due to their three-dimensional (3D) nature. Imaging and dissociation of organoids tends to involve more equipment and a larger investment of resources than in standard 2D cultures. Additionally, organoids lack the vasculature and immunological components that are present in in vivo models, so researchers interested in those aspects of viral infection are advised to seek an alternative protocol.

There are a number of techniques for the formation of human organoids and neurospheres in culture, and they typically fall within the patterned or unpatterned categories. Patterned methods implement factors to regulate Wnt, BMP, TGFβ, and other signaling pathways to push differentiation toward specific lineages23. Unpatterned methods, such as the one described here, take advantage of the propensity for induced pluripotent stem cells (iPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs) to differentiate toward a neuroectodermal lineage by default24. After approximately three weeks of differentiation, the resulting organoids consist of large, biomimetic neuroepithelial structures that contain several cell types that are observed in the early developing brain.

The technique for producing organoids from standard, feeder-free PSC cultures, and infecting these organoids with ZIKV is presented in full. For guidance on the culturing methods needed for feeder-free PSCs, please refer to previous methods publications25,26. Additionally, in order to apply consistent amounts of virus for multiple experiments, it is important to calculate the MOI ahead of time. This is done by conducting an infection of Vero cells, followed by treatment with overlay medium, incubation, and immunostaining. Descriptions and methods of this technique have been previously described19,27.

Once the PSC culture reaches the target confluence of 50%-70%, the cells are then dissociated and aggregated into ultra-low attachment 96-well plates. The cells are maintained for 3 days in xeno-free stem cell maintenance media (SCMM), and then converted to a neural induction media for the remainder of the culture. Once the organoids have differentiated for 3 weeks, the infection can be conducted. By routinely taking images during the week following infection, researchers will observe progressive cell death and disruption of the organoid. Researchers may also dissociate the organoids at this time to conduct transcriptional or proteomic profiling. Cryosectioning and lightsheet methods are recommended for imaging, and researchers can expect to see high levels of infection and viral replication particularly within the neural progenitor cell (NPC) populations in the organoids. Ultimately, this technique allows researchers to rapidly examine the mechanisms of viral infection of the human brain with low cost and limited equipment.

Protocol

1. creazione di Organoids cerebrale da iPSC / hESC cultura 2D (giorno 0) Nota: questo protocollo si presuppone che il mantenimento delle cellule staminali (SC) è praticata in mezzo SCMM con vitronectina o Geltrex substrato. Se si utilizza un’alternativa, ad alta percentuale proteica della cellula formativa, coltura media, si consiglia di culture di SC di transizione a SCMM per almeno due passaggi prima di iniziare la formazione organoid. Il protocollo non è stato testato con metodi basati su alimentatore cultura di SC. SC regolare utilizzo manutenzione metodi 25 , 26, portare culture alla confluenza di 50-70%. Si tratta in genere di 3-4 giorni dopo il passaggio, anche se questo può essere dipendente da linea di metodo e delle cellule di cultura. Nota: Circa 2 pozzi da una piastra a 6 pozzetti sono necessari per produrre una piastra a 96 pozzetti piena dei organoids. Ispezionare culture tramite microscopia a campo chiaro a ingrandimento 10x X-20 affinché la morfologia di Colonia sano, senza differenziazione rilevabile. SCMM portare a 37 ° C in un bagno di acqua calda e disgelo una fiala di 50 µ l di 50 mM Y-27632 (inibitore di roccia) e 2 mL di reagente enzimatico distacco a temperatura ambiente. Preparare un piatto di ben 96 fondo U attacco ultra-basso (ULA), una pipetta multicanale P200 e un serbatoio di reagente 25ml. Aliquot 45 mL di SCMM in una provetta conica da 50 mL e 45 µ l di 50 mM Y-27632. Mix accuratamente da triturazione. Vuoto aspirare i due pozzetti contenenti SCs e rapidamente aggiungere 1 mL di reagente di distacco privo di enzima ad ogni pozzetto usando una pipetta P1000. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 4 min. Vuoto aspirare i pozzetti trattati e aggiungere 1 mL di reagente enzimatico distacco ad ogni pozzetto usando una pipetta P1000. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C per un minimo di 5 ulteriori Rimuovere la piastra ed esaminare i pozzetti trattati. Picchiettare delicatamente sulla piastra per rompere le cellule di aggregati. Se i cluster di grandi cellule sono ancora visibili, incubare la piastra per ulteriori 2 min a 37 ° C. Ripetere questo passaggio fino a quando i cluster non sono visibili ad occhio nudo. Una volta che le cellule sono dissociate correttamente, aggiungere 1 mL di SCMM ad ogni pozzetto per disattivare gli enzimi di dissociazione. Piscina il 4 mL di sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e prendere una piccola aliquota per il conteggio delle cellule. Restituire eventuali pozzetti rimanenti, non trattati nella piastra di manutenzione nell’incubatore a 37 ° C. Mentre il conteggio, centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min. Determinare il numero totale delle cellule e calcolare la quantità di SCMM + Y-27632 soluzione che sarà necessarie per ottenere una sospensione di 60.000 cellule/mL. Attentamente il vuoto aspirare il supernatante e aggiungere il volume calcolato di SCMM + Y-27632 soluzione. Mescolare 5 – 10 volte con una pipetta da 5 mL, assicurando una sospensione cellulare uniforme. Immediatamente trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagente e dispensare 150 µ l in ogni pozzetto della piastra di fondo ULA U 96 pozzetti usando una pipetta multicanale P200. Questo produce 96 organoids individuali, ognuno inizialmente composta da 9.000 celle. Centrifugare la piastra a 150 x g per 1 min. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C e non disturbare la piastra per 48 h. 2. Cerebrale Organoid manutenzione (giorno 2) preparare 17 mL di SCMM con 17 µ l di 50 mM Y-27643 in una provetta conica da 50 mL. Caldo il SCMM + Y-27632 soluzione a 37 ° C in un bagno di acqua calda. Prendere la piastra organoid dall’incubatrice e lentamente usando una pipetta multicanale P200 impostata su 75 µ l, redige di mezzo dal bordo del pozzo in prima fila. Una volta prelevato il mezzo, rapidamente espellere il medium retro nel pozzo per sollevare organoids e cellule sciolte. Ripetere questa operazione per ogni riga. Nota: Questa tecnica, in appresso denominato un " dispersione, " solleva i detriti cellulari e il organoid in sospensione. Il organoid rapidamente scende fino al fondo del pozzo, mentre i più piccoli detriti rimane in sospensione, permettendo così di essere rimosso con un cambiamento di media. Questo aiuta a prevenire la organoid da riposo in detriti cellulari durante la coltura. Dopo tutti i pozzetti sono state disperse, attendere per 15 s per garantire che i organoids hanno affondato alla parte inferiore di ciascun pozzetto. Lentamente e con attenzione 75 µ l di terreno da ogni pozzetto usando la pipetta multicanale P200 di aspirare e dispensare in un serbatoio rifiuto. Nota: Maggior parte degli utenti, occasionalmente, aspirare un organoid durante regolare feed. Questo problema può verificarsi circa l’1% del tempo. Per favore pianificare di conseguenza assicurare che abbastanza organoids sopravvivono ai punti di tempo sperimentale. Trasferire SCMM + soluzione di Y-27632 in un serbatoio di reagente e dispensare 150 µ l in ogni organoid bene usando la pipetta multicanale P200. Inserire la piastra in un incubatore a 37 ° C. 3. Cerebrale Organoid manutenzione (giorno 3) caldo 17 mL di SCMM a 37 ° C, questa volta senza Y-27643. Con la pipetta multicanale P200 impostata a 100 µ l, disperdere tutti i pozzetti della piastra organoid (Vedi punto 2.2). Attendere 15 s per garantire che organoids hanno affondato alla parte inferiore dei loro pozzi. Preparare un serbatoio dei rifiuti e trasferire SCMM riscaldata in un serbatoio di origine. Attentamente aspirare 125 µ l di terreno da ogni pozzetto e sostituire con 150 µ l di fresco SCMM usando la pipetta multicanale P200. Inserire la piastra in un incubatore a 37 ° C. 4. Cerebrale Organoid manutenzione (giorno 4 +) Nota: condurre questa manutenzione regolare ogni altro giorno fino a quando infezione. Prima di iniziare il feed il giorno 4, preparare il supporto di induzione neurale (NI). Disgelo un’aliquota di 250 µ l di eparina di 2 mg/mL, insieme a un flaconcino da 5 mL di supplemento di N-2 X 100. Aggiungere i 250 µ l di eparina, 5 mL di 100 X N-2 e 5 mL di 100 X MEM-NEAA a 500 mL di DMEM / F12 + GlutaMAX. Filtro sterile la soluzione mista in un filtro di 500 mL. Nota: I NI a 4 ° C quando non in uso; NI dura fino a due settimane prima di mezzo fresco deve essere preparata. Caldo 17 mL di terreno di NI a 37 ° C. Con la pipetta multicanale P200 impostata a 100 µ l, disperdere tutti i pozzetti della piastra organoid (Vedi punto 2.2). Attendere 15 s per garantire che organoids hanno affondato alla parte inferiore dei loro pozzi. Preparare un serbatoio di scarico e trasferimento NI riscaldato in un serbatoio di origine. Attentamente aspirare 125 µ l di terreno da ogni pozzetto e sostituire con 125 µ l di fresco NI usando la pipetta multicanale P200. Inserire la piastra in un incubatore a 37 ° C. 5. Infezione di organoid con ZIKV (~ giorno 24) Nota: dopo circa 3 settimane di differenziazione, là will essere neuroepithelial grandi strutture e rosette visibile all’interno di organoid che sarà altamente suscettibile dell’infezione ZIKV. Portare Earle ' s 1 X Balanced Salt soluzione (EBSS), 1x PBS e NI a 37 ° C in un bagno di acqua calda. Diluire ZIKV concentrazione nota in 1 X EBSS all’infezione di destinazione molteplicità di infezione (MOI). Nota: Titolazioni di MOIs differenti sono consigliate per ottenere una reazione al dosaggio virale. Questo può variare da ceppo virale; per ATCC VR-1838 e ATCC VR-1843, MOI tipici valori sono compresi tra 0,1 e 10). Rimuovere attentamente tutte le medie organoid ben usando una pipetta di P200 monocanale. Aggiungere rapidamente 200 µ l di 1X PBS per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale P200 per lavare il organoids. Rimuovere attentamente tutte le medie organoid ben usando una pipetta di P200 monocanale. Rapidamente e aggiungere 50 µ l di 1 X sola EBSS (finto infezione) o soluzione virus ZIKV di bene e di verificare che il organoid sia completamente sommersa. Ripetere per ogni organoid che è di essere infetti per lo studio. Mettete la piastra in un incubatore a 37 ° C per 2 h. Nota: Incubando organoids mock-infettati per questa durata non dovrebbe avere un impatto significativamente loro crescita rispetto ai organoids indisturbato. Circa 30 min prima dell’incubazione virale è completato, aliquotare 25 mL di NI in una provetta conica da 50 mL e portare a 37 ° C in un bagno di acqua calda. Una volta completata l’esposizione virale, lavare il organoids con 200 µ l di 1X PBS per ciascun pozzetto, permettono organoids a stabilirsi per 15 s e poi togliere 1 X PBS utilizzando una pipetta monocanale P200. Aggiungere 200 µ l di NI fresco a ogni bene e inserire nuovamente l’incubatrice. Optional: per un giorno 0 tempo punto, organoids può essere imaged un’ora dopo l’infezione. Continua per cultura sostituendo 125 µ l NI alterni utilizzando il metodo di dispersione (Vedi punto 4). Assicurarsi di smaltire in modo corretto abbiamo trascorso media e suggerimenti, come questo contiene particelle infettive ZIKV.

Representative Results

Durante la giornata di formazione organoid, SC culture dovrebbero essere in fase di crescita del log, in cui sono 50% – 70% confluenti, come mostrato in Figura 1(A-C). Culture dovrebbero formare colonie arrotondati con bordi distinti, e i pozzi dovrebbero essere chiari di differenziazione Figura 1(D-E). Se si verifica la differenziazione, si consiglia di effettuare un prelievo da rimuovere per pulire le zone colpite all’interno delle piastre con almeno un giorno prima per la creazione di organoids. Se una grande parte della cultura è differenziata, può essere necessario condurre un passaggio supplementare, scongelare un nuovo flacone o alter tecniche di coltura di cellule staminali per garantire che il organoids si formano da culture puro delle cellule staminali. La dissociazione di una combinazione di enzimi ed enzimatiche distacco reagenti trattamento dovrebbe condurre per lo più unicellulari, anche se ci possono essere ancora piccoli aggregati di cellule osservate durante il conteggio. La presenza di piccoli aggregati non sembra disturbare organoid formazione, anche se possono avere precisione di conteggio. È consigliabile che più conteggi sono fatti per campione, e se i conteggi variano di oltre il 20%, può essere necessario aumentare il tempo di dissociazione di singolari celle ulteriormente. Una volta che le cellule sono seminate e filate giù in un piatto fondo ULA U 96 pozzetti (Figura 2A), verranno visualizzati come un foglio piatto, denso di cellule sul fondo di ciascun pozzetto. Le cellule si aggregherà lentamente durante i prossimi due giorni. È meglio per non disturbare la piastra durante queste 48 ore, come le forze meccaniche possono interrompere l’aggregato vagamente-formata. Per i primi 10 giorni, il organoid rimarrà per lo più sferica e crescerà da ~ 300 µm a 600-800 µm (Figura 2B). Altre strutture osservabili cominciano ad apparire in organoid tra 10 e 20 giorno (Figura 2C-E). Dal giorno 24, i ricercatori dovrebbero poter osservare rosetta-come le strutture tramite microscopia a campo chiaro (Figura 2F). Continuando la cultura, queste strutture neuroepiteliali possono aumentare in quantità e dimensioni sopra parecchi giorni (Figura 2G). Durante il feed, il ricercatore noterà una considerevole quantità di detriti raccolta sul fondo di ciascun pozzetto, specialmente durante le prime 2 settimane di cultura. La tecnica di dispersione descritta nel passaggio 2.2 rimuove la maggior parte di questo detriti cellulari per impedire che i detriti apoptotici accumulando oltre alimentazioni multiple (Figura 3A). Questo detriti possono interferire con la formazione immagine può rendere più difficili da osservare e quantificare la morte cellulare indotta da infezione e può fornire segnalazione asimmetrica per la vicina organoid che potrebbero influenzare la differenziazione. Se la tecnica di dispersione avviene correttamente, questo dovrebbe essere ridotto (Figura 3B-C, 3D-E). Si raccomanda di condurre cryosections o lightsheet imaging per ispezionare la struttura corticale formando all’interno il organoids. Nel giorno 25 organoids, le strutture di Rosetta e zone ventricolari sono chiaramente visibili in DAPI (Figura 4A) e la macchiatura di fosfo-vimentin (Figura 4B). La presenza di TBR2 (Figura 4C) indica che si stanno formando progenitori intermedi, con una morfologia che suggerisce la migrazione verso l’esterno. MAP2 + (Figura 4D) neuroni popolano regioni esterne di ogni Rosetta. Da queste proteine, si può visualizzare la zona ventricolare (VZ), zona subventricolare (SVZ), zona intermedia (IZ) e placca corticale (CP) all’interno di ogni Rosetta (Figura 4E, 4E’). Si può continuare a coltivare questi organoids al fine di osservare le fasi successive di sviluppo. Mentre non è più prominente in questo tipo di organoid stratificazione corticale, il naturale passaggio al gliogenesis verificarsi molto come avviene in vivo. Questo può essere osservato in organoids giorno 108, in cui una gran parte delle cellule esprimono sia MAP2 o GFAP (Figura 4F-io). Gli utenti possono aspettarsi di vedere differenze nella dimensione del organoid da circa 3 giorni dopo l’infezione di ZIKV, a seconda il MOI virale applicato a organoids (Figura 5A-B). Dopo questi 3 giorni, ci sarà anche un aumento in detriti cellulari nei pozzi infetti rispetto ai pozzi fittizi. Questa differenza di dimensioni organoid aumenterà nel corso della settimana seguente, fino a quando il organoids infetti cominciano a rompersi apart (Figura 5C-D). Una varietà di analisi può essere utilizzata a questo punto per studiare i meccanismi di infezione, tra cui l’estrazione del RNA virale e cryosectioning (consigliato anticorpi riportati nella tabella materiali). Su cryosectioning, gli utenti potranno osservare una grande presenza di virus nella regione apicale delle strutture neuroepiteliali, suggerendo una sensibilità delle cellule progenitrici neurali (NPC) all’infezione ZIKV (Figura 6). Immunofluorescenza di organoids sezionato mostrerà anche un aumento nell’espressione di caspase-3 fenduto nella organoids infetti (Figura 7). Figura 1 : Morfologia di Colonia di cellule staminali prima formazione organoid.Colonie dovrebbero essere confluenti di 50-70% al momento della dissociazione di produrre un gran numero di organoids coerente. (A) Sparse, recentemente seminato culture non hanno ancora raggiunto crescita del log di fase e non produrrà molti organoids. (B) una volta che le cellule raggiungono la confluenza corretta, sono pronti per la dissociazione. Inoltre è importante che queste colonie sono ispezionate per garantire che essi sono chiare di differenziazione. (C) colonie che sono preso troppo lontano raggiungeranno sovra-confluenza e non sono raccomandati per formazione organoid. Culture in questo stato sono più probabile che contengono cellule di differenziazione. (D) Colonia bordi devono essere distinti, con morfologia coerente delle cellule delle cellule arrotondate al centro e leggermente allungata cellule verso i bordi. (E) differenziazione minima dovrebbe essere presente nelle culture. Se le celle più grandi, appiattite sono state osservate nei centri o i bordi delle colonie (frecce bianche) e compongono più di circa l’1% della cultura, è consigliabile che pick da rimuovere o ulteriori passaggi sono condotte per formare una popolazione uniforme di cellule staminali.e.Jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg”target = blank” > Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Crescita organoid cerebrale nel corso del tempo. (A) un diagramma per la produzione di organoids cerebrale da 2D PSC mantenute in medium xeno, alimentatore-free. (B) per i primi 8 giorni, organoids rimarrà per lo più sferica con poche caratteristiche rilevabili. Il diametro della organoid va da circa 300 µm a 500 µm. (C-E) al giorno 10, regioni più chiare inizierà a essere rilevabile intorno alla periferia della organoids e perderanno la loro forma sferica. Essi continueranno ad aumentare di dimensioni di circa 1 mm di diametro, in funzione soprattutto della linea cellulare viene utilizzata per produrre il organoids. (F) dopo circa 20 giorni di differenziazione, utenti potranno osservare la formazione di strutture neuroepiteliali (frecce nere) nelle regioni periferiche chiara della maggior parte dei organoids. Questi hanno una morfologia a forma di anello, con strutture apicali e basali che imitano quelli della corteccia in via di sviluppo. (G) queste strutture neuroepiteliali continuerà a crescere e aumentare di dimensioni per circa 20-30 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Feed di schiarimento di detriti cellulari tramite dispersione tecnica.Durante la crescita organoid, una grande quantità di morte delle cellule è da aspettarselo e può portare ad accumulo di detriti cellulari che circondano la base della organoid. (A) la tecnica di dispersione raffigurato permette ai ricercatori di rimuovere la maggior parte di questi detriti durante ogni feed. Per fare questo, usando una pipetta multicanale P200, lentamente, redigere il mezzo usato ed espellerla rapidamente per sollevare il organoid e detriti cellulari in sospensione. Il organoid scenderà rapidamente sul fondo del pozzo, momento in cui può essere condotta un regolare feed. Esempi di un giorno 6 organoid prima (B) e dopo (C) dispersione alimentazione Mostra riduzione considerevole detriti. Questo continua per diverse settimane, come mostrato da un organoid 18 del giorno prima (D) e dopo (E) dispersione di alimentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Caratterizzazione dei organoids cerebrale tramite immunohistochemistry.Lightsheet immagini di organoids cerebrale sono indicate per fornire un esempio di architettura cellulare che si forma. Al giorno 25, DAPI (A) e fosforo-Vimentin (B) indicare rosette e le zone ventricolare, rispettivamente. (C) TBR2 etichette progenitori intermedi che stanno migrando verso l’esterno e MAP2 (D) etichette di neuroni che si sono formate nel piatto corticale. (E, E’) La combinazione di queste proteine mostra chiaramente la ricapitolazione dello sviluppo corticale nei modelli organoid cerebrale. (F-I) Di giorno 108, gliogenesis si è verificato, con una miscela di GFAP + e cellule MAP2 + popolamento gran parte la organoid. VZ = zona ventricolare, SVZ = zona subventricular, IZ = zona intermedia, CP = piatto corticale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Degradazione dei organoids infetti. Immagini di campo luminoso (A) di Mock e ZIKV-infettati organoids cerebrale a MOI = 0,1 e 10. Immagini sono state scattate subito dopo l’infezione (giorno 0), così come 3 e 6 giorni dopo l’infezione. (B-C) Immagini di campo chiaro dei detriti cellulari che circondano mock (B) e (C) ZIKV-infettati in MOI = 10 organoids cerebrale 3 giorni post-infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Donatrici e immunofluorescenza di infetti organoids.Giorno 24 organoids sono stati esposti a ZIKV a MOI = 0,1 e cryosectioned dopo 6 giorni. In questa fase, c’è una chiara presenza di virus nelle zone ventricolare, subventricular e intermedi di organoid, dove risiedono le cellule progenitrici neurali e glia radiale. (A) Via macchiatura nucleare, queste regioni neuroepithelial sono chiaramente visibili dovuti (frecce bianche) per l’alta densità dei nuclei che formano l’anello-come le strutture intorno alla superficie apicale. (B) macchiando per la busta virale, si può osservare una relativamente alta presenza di virus all’interno di queste strutture di Rosetta (frecce bianche). Nota che c’è una piccola quantità di virus presente in varie cellule periferiche non identificate. (C-D) MAP2 o altro neurone-specific macchie mostrano che ci sono neuroni presenti nelle culture che sembrano non essere infettato dal virus quando sovrapposte con la macchia virale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 : Spaccati caspase-3 immunofluorescenza di infetti organoid.Dopo l’infezione, si possono usare indicatori apoptotici per studiare i meccanismi della morte delle cellule che si verificano all’interno del organoids. In questo esempio, il giorno 24 organoids sono stati esposti a ZIKV a MOI = 0,1 e cryosectioned dopo 6 giorni. (A) non infetti organoids non mostrare nessuna busta virale (2 di 4 proteine) e una quantità minima di caspase-3 fenduto a causa apoptosi omeostatico che si verificano nel tessuto. (B) Infected rosette iniziano a mostrare i livelli aumentati di apoptosi. (C) rosette che mostrano infezione severa via 4 2 colorazione anche tendono a mostrare livelli elevati di caspase-3 fenduto in queste regioni. C’è una correlazione diretta tra la gravità della infezione e fenduto caspase-3 espressione all’interno delle rosette infetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Esistono diversi aspetti da considerare quando si utilizza organoids cerebrale umana per indagare l’infezione ZIKV. Un’importante considerazione è che la formazione organoid e struttura dipende fortemente dalla linea di cellule staminali da cui sono formate. Prendersi cura quando si confrontano tra linee cellulari, compreso isogenic lines ingegnerizzati; si consiglia di fare conclusioni utilizzando più subcloni e idealmente più linee di cellule staminali. Inoltre a causa di questa differenza nelle linee cellulari, esperimenti pilota per garantire che corretta differenziazione è in corso nella organoids è consigliabile. Mentre le strutture di neuroepithelial sono visibili mediante microscopia in campo chiaro, inoltre è suggerito per condurre esperimenti qRT-PCR o cryosectioning per cercare gli indicatori di differenziazione neurale come PAX6 o fosfo-vimentin.

Si dovrebbe anche prevedere considerevole variabilità tra organoids all’interno della stessa linea cellulare. A causa della natura non nanostrutturata del protocollo, il numero e le dimensioni delle strutture neuroepiteliali può variare tra organoids individuali. In genere, ci si può aspettare almeno due grandi (> 200 µm di diametro da D24) neurale rosette a organoid. Per questo motivo, gli studi longitudinali, come l’osservazione del cambiamento nella dimensione organoid dopo l’infezione, sono particolarmente illuminanti. Variabilità tra lotti potrebbero verificarsi, con la causa più probabile per questo essendo conta cellulare imprecise o semina. È consigliabile condurre più conteggi e per assicurarsi che la sospensione cellulare è ben miscelata prima della semina sulle piastre di fondo ULA U 96 pozzetti.

Quando la coltura organoids in fondo ULA U 96 pozzetti, intenzione vedendo evaporazione considerevoli effetti intorno ai bordi delle piastre. È ideale per riempire questi pozzetti con PBS e funzionano solo con il centro 60 wells. Dovuto all’evaporazione, organoids nei pozzetti esterni saranno esposti a condizioni diverse rispetto a quelle del centro, che probabilmente interesserà la loro crescita e la differenziazione. Si prega di considerare questo quando si pianifica il numero di organoids che saranno necessarie per gli esperimenti. Inoltre, organoids inizierà a soppiantare il formato 96 pozzetti dopo circa 30 giorni, che sarà visibile a causa lo sbiadimento del terreno di coltura. Se l’intenzione di prendere il organoids negli ultimi 30 giorni, si consiglia di trasferire la organoids per una piastra a 24 pozzetti ULA. Per effettuare il trasferimento, usare le forbici per tagliare un suggerimento P1000, in modo che l’apertura è molto più grande il organoids se stessi e trasferire la organoids pipettando.

Organoids cerebrale umana tenere grandi potenzialità nel promuovere la comprensione del campo del neurosviluppo e malattia. I ricercatori sono incoraggiati a modificare il protocollo come necessario. Ad esempio, uno potrebbe implementare fattori di campitura per migliorare l’efficienza di differenziazione verso tipi cellulari specifici, permettendo loro di esplorare l’impatto virale su alcune regioni anatomiche. Gli effetti sullo sviluppo neurologico del ZIKV sono ancora poco conosciuti, ma questo nuovo approccio darà ai ricercatori un modo accessibile, rapido e ad alta produttività di indagare i meccanismi dell’infezione.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Priscilla L. Yang e Dominique J. Burri della Harvard Medical School per aiuto con propagazione iniziale e la quantificazione dei ZIKV. Vorremmo anche ringraziare Nathaniel D. Kirkpatrick per il supporto dell’imaging. K.E. è stato sostenuto dal centro di Stanley per la ricerca psichiatrica e l’Harvard Stem Cell Institute.

Materials

Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 StemCell Technologies 5940 Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton.  Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR StemCell Technologies 5873
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase Gibco A11105-01 Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary
Y-27632 Selleck Chem S1049 Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) Gibco 10565-018 (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502-048
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) Gibco 11140-050
Heparin Sigma-Adrich H4784-1G Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) GE Healthcare Life Sciences SH30029.02
Stericup Filter (500mL) Millipore 220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom Corning 7007
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) Integra 4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ Rainin 17013810
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible Thermo Scientific 75007210
Culture Plate Centrifuge Rotor Thermo Scientific 75005706
Vero Cells ATCC CCL-81 For virus expansion, if necessary
Zika Virus (Uganda Strain) ATCC VR-1838 Other strains may be used
Zika Virus (Puerto Rico Strain) ATCC VR-1843 Other strains may be used
phospho-vimentin MBL D076-3 mouse polyclonal,  1:250 dilution
TBR2 Abcam ab23345 rabbit polyclonal, 1:300 dilution
MAP2 Novus NB300-213 chicken polyclonal, 1:1500 dilution
GFAP Cell Signaling Technologies CST12389S rabbit polyclonal, 1:200 dilution
D1-4G2 flavivirus envelope protein EMD Millipore MAB10216 mouse monoclonal, 1:500 dilution
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technologies 9661 rabbit polyclonal, 1:200 dilution
488 anti-mouse IgG Thermo Fisher A-11001 goat polyclonal, 1:1000
594 anti-rabbit IgG Thermo Fisher A-11037 goat polyclonal, 1:1000 dilution
647 anti-chicken IgY Thermo Fisher A-21449 goat polyclonal, 1:1000 dilution
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Riferimenti

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Salick, M. R., Wells, M. F., Eggan, K., Kaykas, A. Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids. J. Vis. Exp. (127), e56404, doi:10.3791/56404 (2017).
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