Protocolo de un solo paso para la evaluación del modo de muerte celular inducida por radiación de la Clonogenic por microscopía de fluorescencia
Summary
Investigación sobre radiación ionizante (IR)-muerte de las células clonogenic inducido es importante para comprender los efectos de IR en tumores malignos y los tejidos normales. Aquí, describimos un análisis de un solo paso para la evaluación de los modos principales de la muerte celular inducida por IR clonogenic basado en morfología de 4′, diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-tinción de núcleos visualizados por microscopía de fluorescencia.
Abstract
Investigación sobre radiación ionizante (IR)-muerte de las células clonogenic inducido es importante para comprender el efecto de IR en tumores malignos y los tejidos normales. Aquí, describimos un análisis de un solo paso rápida y rentable para evaluar simultáneamente los modos principales de clonogenic la muerte celular inducida por IR, es decir, apoptosis, catástrofe mitótica y senescencia celular. En este método, las células cultivadas en un cubreobjetos son irradiadas con rayos x y teñidas con 4′, diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopía de fluorescencia, catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular se identifican basados en la morfología característica de los núcleos teñidos de DAPI. Apoptosis es determinada por la presencia de cuerpos apoptóticos (es decir, núcleos de condensación y fragmentación). Catástrofe mitótica es determinada por la presencia de núcleos que presentan dos o más lóbulos distintos y micronúcleos. Senescencia celular está determinada por la presencia de senescencia asociada heterochromatic focos (es decir, ADN nuclear que contiene focos brillantes, densos de 30-50). Este enfoque permite al experimentador para fácilmente detectar modos de muerte de células clonogenic utilizando diferentes líneas celulares, opciones de tratamiento o puntos del tiempo, con el objetivo de dilucidar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Introduction
Radiación ionizante (IR) induce múltiples modos de muerte de las células clonogenic. Investigación sobre la muerte celular inducida por IR clonogenic es importante para la comprensión de la toxicidad de IR a los tejidos normales, así como para el desarrollo de métodos para aumentar la eficacia del tratamiento de la radioterapia del cáncer. Catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular son los modos principales de clonogenic la muerte celular inducida por IR1. La apoptosis es un modo de regulación de muerte celular que se inicia por ADN daños1. Catástrofe mitótica es la muerte celular que se produce por mitosis aberrante resultando de rupturas de roturas de doble cadena de ADN1. Senescencia celular se define como un estado celular irreversible crecimiento detención2; Tenga en cuenta que la senescencia celular no es la muerte celular per se, pero es un modo de muerte de las células clonogenic porque suprime la supervivencia clonogenic de la célula senescente.
Varios ensayos de células se han desarrollado para evaluar individualmente la catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular. Apoptosis puede evaluarse por terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end etiquetado (TUNEL) de tinción, tinción de anexina V, análisis de fragmentación de ADN y sub-G1 ciclo celular fase determinación por citometría de flujo1. Catástrofe mitótica puede evaluarse por la inmunofluorescencia que manchaba para marcadores mitotic, incluyendo MPM2, tinción TUNEL y la microscopia electrónica1. Senescencia celular puede ser evaluada por coloración asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-Gal), pruebas de detención de crecimiento y microscopia electrónica1. Lo importante es el modo predominante de muerte de las células clonogenic diferencia entre líneas celulares y tratamiento ajustes3,4. Por lo tanto, para dilucidar el perfil global de muerte de las células clonogenic para un determinado ajuste experimental, múltiples ensayos cubriendo todos estos modos de muerte se realizarán juntos, que es trabajo y costosa.
En este artículo se describe un ensayo de un solo paso rápida y rentable para evaluar simultáneamente la catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular inducida por IR3,4. En este método, las células cultivadas en un cubreobjetos son irradiadas con rayos x y teñidas con 4′, diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopía de fluorescencia, catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular son cada uno identificados basados en las morfologías características respectivas de los núcleos teñidos de DAPI. Este enfoque será útil para aplicaciones tales como detección de perfiles de la muerte de células clonogenic en varias líneas celulares, ajustes de tratamiento y puntos del tiempo, con el objetivo de investigar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo son los siguientes. En primer lugar, las células deben cultivarse en la placa de cultivo como una monocapa evaluación morfológica de los núcleos teñidos de DAPI es difícil para las células de varias capas. Para ello, en el paso 2.9, se recomienda cuidado de transferencia de la placa de cultivo a una incubadora; agitación de la placa de cultivo genera un remolino de células suspendidas que conduce a la concentración de células en el centro de la placa de cultivo. Además, debe evitarse la overconfluence llevando a las células de varias capas. Para ello, en el paso 2.7, puede modificarse el número de células sembradas en la placa de cultivo basado en la población, duplicando el tiempo y el intervalo entre la irradiación y la fijación. Se recomienda una confluencia de aproximadamente 80 en el momento de la fijación. En segundo lugar, la velocidad es importante en la fijación y coloración de DAPI (es decir, los pasos 4 y 5). La muestra inconsistencia en relación con el tiempo estos pasos puede conducir a heterogeneidad en la intensidad de la señal DAPI en los núcleos, que oscurecería la evaluación morfológica.
En el paso 2.2, se puede aumentar el número de cubreobjetos en un plato de cultura única; un máximo de cuatro cubreobjetos puede colocarse en un plato de 35 mm, y el número puede aumentarse aún más con platos más grandes. Colocar cubreobjetos múltiples en cada placa de cultivo permite la operación eficiente de evaluación de cursos de tiempo para un tratamiento (es decir, la tapa se desliza se puede recoger de un plato de cultura uno por uno en múltiples momentos de interés).
En el paso 3.2, la dosis puede modificarse según los intereses de los investigadores. La aplicación de una dosis constante en múltiples líneas celulares permite la comparación de la sensibilidad a cada modo de la muerte de las células clonogenic entre las líneas celulares. Por otro lado, el uso de iso-clonogenic supervivencia dosis para cada línea celular permite la comparación de perfiles de la muerte de células clonogenic entre las líneas celulares. La dosis de supervivencia clonogenic iso puede determinarse por el análisis de supervivencia clonogenic12. El valor de10 D, la dosis que ofrece 10% de clonogenic de supervivencia, es un punto final común para la dosis de supervivencia iso clonogenic.
En el paso 3.3, el momento de la irradiación de fijación puede ser modificado según el interés de los investigadores; Esto es importante porque el tiempo de pico de apoptosis inducida por IR, catástrofe mitótica y senescencia celular varía según tratamiento y línea celular. En este artículo, utilizamos 72 h después de la irradiación como el punto de tiempo que sería más útil para el cribado inicial de perfiles de muerte de células clonogenic, basado en múltiples estudios de nuestro grupo y otros se describen como sigue1,2, 3 , 4 , 8 , 9: () inducida por rayos X de apoptosis en células establecidas en su mayoría de tumores sólidos se produce unos días después de la irradiación. (ii) X-ray inducida por catástrofe mitótica en las células cancerosas se produce principalmente en la segunda o tercera mitosis después del lanzamiento de la detención del ciclo celular temporal inducida por la irradiación. La liberación ocurre generalmente aproximadamente 24 h después de la irradiación, seguida por mitosis repetidas a intervalos de aproximadamente 24 h. (iii) senescencia celular inducida por rayos X se hace evidente después de un intervalo depende de la línea celular en cuestión: 2 días después de irradiación para algunos casos tempranos y 7 días después de la irradiación para la mayoría de las líneas de la célula. Después de obtener una visión global de la célula de clonogenic perfiles de muerte de la proyección inicial, tiempo experimentos curso proporcionará una aclaración más detallada de la hora pico para cada modo de clonogenic muerte celular en la línea celular específica o condición de interés4.
Cabe señalar que el DAPI coloración ensayo y el ensayo de supervivencia de clonogenic, un método estándar de oro para la evaluación de la sensibilidad de la radiación, no son intercambiables. Apoptosis y catástrofe mitótica sólo durar por horas. Así, el DAPI tinción ensayo para un determinado momento detecta apoptosis y catástrofe mitótica que se produce en el momento de la evaluación. Por otro lado, los resultados de la supervivencia de clonogenic de ensayo en un momento dado punto de incluir la cantidad total de catástrofe mitótica que había ocurrido durante el período de incubación de típicamente 10 a 14 días después de la irradiación y la apoptosis. A diferencia de la apoptosis y catástrofe mitótica, las células senescentes permanecen en el plato de la cultura; se acumulan gradualmente con el tiempo después de la irradiación. Por lo tanto, los resultados de ambos el DAPI coloración ensayo y el ensayo de supervivencia de clonogenic reflejan la cantidad total de senescencia que ocurrieron durante el período de incubación. Lo importante es la proporción de catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia inducida por la irradiación varía ampliamente según la célula dosis de irradiación y línea. Tomados en conjunto, en teoría, los resultados de un ensayo no puede traducirse directamente en ésos del otro ensayo.
El DAPI ensayo de tinción tiene algunas limitaciones. En primer lugar, sigue siendo polémico si la catástrofe mitótica es un modo distinto de la muerte celular. En el campo de la biología de la radiación, catástrofe mitótica se considera un importante modo de muerte celular inducida por IR que es distinta de otros mecanismos de muerte de células clonogenic1. Por otra parte, otros sostienen que esa catástrofe mitótica no es un modo distinto de muerte celular, sino más bien un proceso que precede la muerte de las células incluyendo la apoptosis y la necrosis13,14. Así, la apoptosis y catástrofe mitótica pueden superponerse hasta cierto punto. En segundo lugar, anteriores estudios sugieren que la senescencia celular puede ocurrir en ausencia de SAHF en algunas líneas celulares y la configuración de tratamiento2. En el presente, otros ensayos diseñados específicamente para cada celda de clonogenic muerte puede usarse para aumentar la robustez de las conclusiones de un experimento dado. En tercer lugar, el DAPI ensayo de tinción puede evaluar modos de muerte de las células clonogenic excepto catástrofe mitótica y apoptosis y senescencia celular (p. ej., necrosis y autofagia). En cuarto lugar, la utilidad de la DAPI ensayo de tinción como predictor de respuesta tumoral a la radioterapia no ha sido dilucidada en la clínica. Desde este punto de vista, el análisis clonogenic de supervivencia, que evalúa la cantidad total de muerte de las células clonogenic, es superior a la DAPI tinción ensayo porque se ha establecido una correlación entre SF2, la fracción sobreviviente de células irradiadas con 2 Gy Rayos x y la respuesta del tumor a la radioterapia15. Sin embargo, cabe destacar que el análisis de supervivencia de clonogenic no se utiliza ampliamente en la clínica, principalmente debido a la exigencia de un alto grado de especialización y un largo período de tiempo (es decir, 14 días) para adquisición de datos. En comparación, el procedimiento para la DAPI tinción de ensayo es más simple y toma mucho menos tiempo, aproximadamente 3-4 días, para generar resultados. La utilidad de la tinción DAPIensayo como predictor de respuesta tumoral a la radioterapia se probará en la clínica en un futuro cercano.
En Resumen, el DAPI tinción ensayo es un ensayo de paso rentable evaluar simultáneamente los tres modos principales de la muerte celular inducida por IR clonogenic. Este enfoque permite fácilmente la pantalla para los modos de la muerte de las células clonogenic de diversas líneas celulares, ajustes de tratamiento y puntos del tiempo, con el objetivo de dilucidar los mecanismos de muerte celular en las células diana y las condiciones de interés.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Akiko Shibata para asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón para programas de posgrado líder, cultivo de líderes mundiales en ingeniería y terapéutica de iones pesados.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
Riferimenti
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