형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 세포 해야 될 성장 문화 접시에는 단층으로 다층 셀 어렵습니다 DAPI 스테인드 핵의 형태 평가 실시 하기 때문에. 2.9, 단계에서이 끝에 인큐베이터에 문화 접시의 주의 전송 것이 좋습니다; 문화 접시의 동요 문화 접시의 중앙에 세포의 농도에 이르게 중단된 셀의 소용돌이 생성 합니다. 또한, overconfluence 다층 셀 선도 피해 야 한다. 이 위해, 단계, 2.7에서에서 문화 접시에 시드 셀 수 시간과 방사선 및 고정 사이의 간격을 두 배로 하는 인구에 따라 수정할 수 있습니다. 고정 시간에 약 80의 합류는 것이 좋습니다. 둘째, 속도 고정 및 DAPI 얼룩 (즉, 4-5 단계)에서 중요 하다. 이러한 단계에 대 한 시간에 관한 간 샘플 불일치가 형태학 평가 애매 한 것이 핵에 DAPI 신호 강도 발생할 수 있습니다.

2.2 단계에서 단일 문화 접시에 커버 슬립의 수를 증가 수 있습니다; 4 덮개 미 끄 러 짐의 최대 35 mm 접시에 놓일 수 있다 그리고 더 큰 접시를 사용 하 여 수를 더 증가 될 수 있다. 여러 표지 전표 각 문화 접시에 배치 (즉, 커버 전표 관심의 여러 시간 점에서 문화 접시 하나 하나에서에서 수집 될 수 있습니다) 특정된 치료에 대 한 시간 코스 평가의 효율적인 운영 수 있습니다.

3.2 단계에서 방사선 복용량은 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 여러 셀 라인에 일관 된 복용량의 응용 프로그램에는 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 감도의 비교 수 있습니다. 다른 한편으로, 각 셀 라인에 대 한 iso clonogenic 생존 복용량의 사용 비교를 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음 프로필의 있습니다. Iso clonogenic 생존 복용량 clonogenic 생존 분석 결과^12에의해 결정 될 수 있습니다. D₁₀ 값 10 %clonogenic 생존을 제공 하는 복용량 iso clonogenic 생존 복용량에 대 한 일반적인 끝점입니다.

3.3 단계에서 고정 하는 방사선에서 시간; 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 적외선 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 피크 시간 셀 라인 및 치료에 따라 다르기 때문에 이것이 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 clonogenic 세포 죽음 프로필, 우리의 그룹에 의해 여러 연구에 따라의 초기 심사에 가장 유용할 것 이다 시간 지점으로 방사선 조사 후 72 h를 사용 하 고 다른 설명 다음과 같습니다^{1,2, 3 , 4 , 8 , 9}: (i) X-레이-유도 된 apoptosis 단단한 종양에서 주로 설립 셀에 발생 하는 방사선 조사 후 몇 일. (두 번째 또는 세 번째에서 가장 눈에 띄게 발생 하는 암 세포에 mitotic 재앙 ii) X-레이-유도 방사선에 의해 유도 된 임시 세포 주기 검거에서 출시 후 유사 분열. 릴리스는 일반적으로 다음, 방사선 조사 후 약 24 시간 발생 반복된 mitoses 약 24 h. (iii)의 간격에 의해 X-레이-유도 세포 노화 된다 분명 후 셀 라인에 의존 간격: 2 일 후 일부 초기 사례 및 대부분의 셀 라인에 대 한 방사선 조사 후 7 일에 대 한 조사. 취득 후 clonogenic 셀의 전반적인 그림 죽음 프로필 초기 심사, 시간 과정 실험 clonogenic 세포 죽음의 상태 또는 특정 셀 라인의 각 모드에 대 한 피크 타임의 자세한 설명을 제공할 것입니다 이자⁴.

그 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 방사선 민감도 평가 대 한 표준 메서드는 주목 한다. Apoptosis와 mitotic 재앙만 시간 지속. 따라서, 주어진된 시간 지점에 대 한 분석 결과 얼룩 DAPI apoptosis와 평가의 시간 지점에 mitotic 재앙을 감지 합니다. 다른 한편으로, clonogenic 생존의 결과 포인트 apoptosis와 mitotic 재앙 발생 했다 잠복기 동안 일반적으로 방사선 조사 후 10-14 일의 총 금액을 포함 하는 주어진된 시간에 시험. Apoptosis와 mitotic 재앙, 노화 세포에서 다른 문화 접시;에 남아 그들은 방사선 조사 후 시간이 지남에 따라 점차적으로 축적. 따라서, 둘 다의 결과 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 반영 인큐베이션 기간 동안 발생 한 노화의 총 금액. 중요 한 것은, apoptosis, mitotic 혁명과 방사선에 의해 유도 된 노화의 비율이 다릅니다 널리 셀 선 및 방사선 복용량. 함께 찍은, 이론적으로, 한 시험의 결과 변환할 수 없습니다 그 다른 분석 결과에 직접.

DAPI 시험을 얼룩이 지는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, mitotic 재앙 세포 죽음의 다른 모드 인지 논란이 남아 있습니다. 방사선 생물학의 분야, mitotic 재앙은 clonogenic 세포 죽음¹의 다른 장치에서 IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 간주 됩니다. 다른 한편으로, 다른 그 mitotic 재앙은 세포 죽음 그러나 apoptosis와 괴 사^13,14를 포함 하 여 세포 죽음 앞에 오히려 프로세스의 고유 모드 논쟁. 따라서, apoptosis와 mitotic 재앙은 어느 정도 겹칠 수 있습니다. 둘째, 이전 연구는 세포 노화 일부 세포 치료 설정²에서 SAHF의 부재에서 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 각 clonogenic 셀을 위해 설계 된 현재, 다른 분석 실험에서 죽음 모드는 주어진된 실험의 결론의 견고성을 높이기 위해 사용 되어야 한다. 셋째, 시험을 얼룩이 DAPI apoptosis, mitotic 재앙, 세포 노화 (예, 괴 사 및 autophagy) 이외의 clonogenic 세포 죽음의 모드 평가 수 없습니다. 넷째, 분석 결과 종양 방사선 치료 반응의 예측으로 얼룩 DAPI 유틸리티 하지 병원에 해명 되었습니다. 이 관점에서 clonogenic 세포 죽음의 총 금액을 평가, clonogenic 생존 분석 결과 상관 관계 SF2, 셀 2 Gy와 반구의 살아남은 분수 간에 설정 된 때문에 시험을 얼룩이 DAPI에 우수한 X-레이, 그리고 방사선 치료¹⁵종양 응답. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 데이터 수집을 위한 clonogenic 생존 분석 결과 주로 전문성의 높은 학위와는 오랜 기간 (즉, 14 일)에 대 한 요구 사항으로 인해 병원에 널리 활용 되지가 주목 된다. 비교 함으로써, DAPI 얼룩 분석 결과 대 한 절차 간단 하 고 시간이 크게 단축, 약 3-4 일, 결과를 생성. DAPI 얼룩의 유틸리티방사선 치료 종양 응답의 예언자로 서 분석 결과 가까운 장래에 병원에서 테스트 됩니다.

요약 하자면, 분석 결과 얼룩 DAPI clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 세 가지 주요 모드를 동시에 평가 하는 비용 효율적인 단계 분석 결과 이다. 이 이렇게 쉽게 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 시간 포인트, clonogenic 세포 죽음의 모드에 있습니다.