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Biochimica

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々 なタンパク質。

Abstract

非正規の核酸の二次構造 G quadruplexes (G4) は、DNA 複製、転写、RNA プロセシング、テロメア伸長などの多様な細胞プロセスに関与しています。これらのプロセスの中に様々 な蛋白質はバインドし、職務の遂行に G4 構造を解決します。G4 の関数は、多くの場合その折り畳まれた構造の安定性に依存、G4 結合蛋白質が G4 の安定性を調節する方法を調査することが重要です。この作業は、リアルタイムで G4 分子に G4 結合タンパク質の制御の研究を可能にする磁気ピンセットを使用して単一の G4 分子を操作するためのメソッドを示します。一般的には、このメソッドは、タンパク質・ リガンド相互作用の様々 な DNA または RNA 二次構造に規制研究アプリケーションの広い範囲に適しています。

Introduction

4 本鎖 DNA や RNA の G4 の構造は、多くの重要な生物学的プロセス1に重要な役割を果たします。多くの蛋白質は、G4 のバインディングとテロメア結合タンパク (テロメラーゼ、POT1、RPA、TEBPs、TRF2) などの規制に関与している1,2, 転写因子 (ヌクレオリン化における PARP1)3、RNA プロセシング蛋白質 (hnRNP A1hnRNP A2)4ヘリカーゼ (BLM、FANCJ、RHAU、警告、Dna2、Pif1)5、DNA 複製関連蛋白質 (Rif1、REV1, PrimPolymerase)6に。蛋白質の結合を安定化したり G4 構造を不安定にします。したがって後続の生体機能を調節します。G4 の安定性は、熱溶融性 uv (紫外線) や円偏光二色性 (CD) の方法7を使用して測定しました。ただし、そのような条件は、生理学的な関連、タンパク質7のバインドの効果の研究に適用することは困難。

1 分子操作技術の急速な発展は、折りたたみとリアルタイム8ナノメートルの分解能での単一分子レベルでのタンパク質や DNA など、生体分子のアンフォールディングの研究を可能にしました。原子間力顕微鏡 (AFM)、光ピンセットや磁気ピンセットは、最も一般的に使用される単一分子操作方法です。原子間力顕微鏡、光ピンセット9と比較して、磁気ピンセットはドリフト防止法10,11を使用して、日間折り畳み展開単分子動態の安定した測定を許可します。

ここでは、結合蛋白質による G4 安定性の規制を検討する磁気ピンセットを用いた単一分子操作プラットフォームは報告された12,13です。この作品では、サンプルと流れチャネルの準備、磁気ピンセットのセットアップ力校正など、基本的な方法について説明します。コンスタント ・ フォース (力クランプ) など、さまざまな力のコントロールの下で長い時間測定を可能にする力の制御とドリフト防止プロトコルに記載されている手順 3 として、読み込み定数 (力ランプ)、速度し力ジャンプ測定。手順 4 で説明した力校正プロトコルによりの力校正 < 広い力短い綱を 1 μ m の範囲まで 100 pN は、10% 以内の相対誤差と。RNA ヘリカーゼの安定性の規則の例は、RNA G4 はこのプラットフォームの13のアプリケーションをデモンストレーションするために使用の解決に重要な役割を果たしている AU 豊富な要素 (RHAU) ヘリカーゼ (別名 DHX36、G4R1) に関連付けられています。

Protocol

1 です単一分子の伸張のための準備の G4 DNA 準備 5 '-チオール ラベル及び 5 '-5 を使用してラムダ ファージ DNA テンプレートの DDNA ポリメラーゼを用いた PCR によるビオチン dsDNA ハンドル '-チオールと 5 '-ビオチン。プライマー 14 ( 図 1)。両方 dsDNA のハンドルがある高い GC の内容 (> 60%) DNA を防ぐために溶融高力または overstretching …

Representative Results

この図の拡大版を表示するのにはここ。 G4 の展開図 5: ジャンプ力測定。力中にビード高さ変化 (A) 代表的な時間トレース 1 pN と 54 pN 10 DmRHAU、なしで測定のサイクルをジャンプ nM DmRHAU が、ATP、なしと両方が 10 nM DmRHAU と 1 mM ATP、図パネルに記載されています。(B…

Discussion

上記、G4 DNA の力学的安定性と G4 を使用して蛋白質の相互作用を研究するためのプラットフォームとして、単一分子磁気ピンセットが報告されます。プラットフォームを伴い、G4 DNA テザーと折り畳み展開ダイナミクス計測とナノメートル特別決議と G4 の構造安定性を見つけることの非常に効率的なプロトコルが開発されています。フォーカル プレーン ロックにより非常に安定したのドリフ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者が原稿を校正孟パンをありがちましょう。この作品はサポートによってシンガポール省の教育学術研究基金第 3 層 (MOE2012-T3-1-001) J.Y.; にJ.Y.; ことシンガポール メカノバイオロジー研究所を通じて国立研究財団国立研究財団、その NRF Investigatorship プログラム (NRF Investigatorship 賞号の下で総理大臣のオフィス、シンガポール、J.Y.; に NRF-NRFI2016-03H. Y に中央大学 (2017KFYXJJ153) の基礎的研究基金。

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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Riferimenti

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochimica. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

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G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

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Citazione di questo articolo
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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