Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità
Summary
Descriviamo qui un’analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.
Abstract
Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l’aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l’aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l’interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l’infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l’infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l’aterosclerosi).
Introduction
Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo1,2. Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi1,2. Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL1,2, il meccanismo con cui HDL attenua l’inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso 3,4. Così, è stato suggerito che la complessa struttura e la funzione di assoluto livello di HDL piuttosto che può prevedere più accuratamente aterosclerosi 5,6,7,8. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l’aterosclerosi. Questi i) ridurre le potenziali efflusso di colesterolo 9, ii) diminuire anti-infiammatori e aumentare HDL-collegati di proteine pro-infiammatorie 6,7, iii) ridurre i livelli di fattore antiossidante e attività e HDL capacità di inibire l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDLox)10 e iv) aumentare del lipido del perossido d’idrogeno contenuto e redox attività (HDLox)9,11. Saggi di robusti che valutano le funzioni di pleotropic di HDL (ad esempio di efflusso di colesterolo, funzione antiossidante) possono complementare determinazione del HDL-HDL-C nella clinica.
La funzione di HDL è solitamente valutata dai metodi basati su cellule quali il colesterolo efflusso dosaggio8,12,13,14. Questi metodi hanno limiti principali tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi 7,15. Questi inconvenienti pongono difficoltà per grandi studi clinici16. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. L’efflusso di colesterolo è una delle funzioni più importanti di HDL, ma può essere determinato solo da analisi cell-based. Altri approcci per determinare la funzione di HDL come proteomica17,18,19,20,21,22,23, 24 e chemiotassi del monocito basati su cellule di HDL funzione 17,22,25 non sono state standardizzate e non può essere utilizzati negli studi umani su larga scala.
HDL ha antiossidanti significative atheroprotective effetto5,6,7,8. La funzione antiossidante di HDL è stata determinata in presenza di LDL in precedente cella analisi fluorometriche gratis 26. Questi metodi fluorometrica biochimici della funzione antiossidante di HDL sono stati originariamente sviluppati da Mohamad Navab e Alan Fogelman e loro colleghi26. Anche se molti studi umani hanno utilizzato questi metodi per determinare HDL funzione 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipidi (HDL)-lipidica (LDL) e interazioni lipido-fluorocromo possono limitare la riproducibilità di questi saggi biochimici non enzimatico libero delle cellule del HDL funzione27,28.
L’interesse recente si è concentrata sulle conseguenze funzionali dell’ossidazione di HDL che è il risultato dell’ossidazione di lipidi e di proteine all’interno di HDL 27,29,30. Studi precedenti hanno dimostrato che l’ossidazione di HDL altera HDL funzione 27,29,30. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Così il contenuto di perossido lipidico HDL può essere utilizzato per determinare HDL funzione 9,17,20,31 e dato le limitazioni note di analisi preventiva di HDL funzione7, 15,27,32, abbiamo sviluppato un metodo fluorimetrico alternativo che quantifica HDL lipidi perossido contenuto (HDLox) 32. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C 32. Il principio biochimico del dosaggio è mostrato nella Figura 1. Abbiamo dimostrato che questo approccio basato sulla fluorescenza non ha le limitazioni del precedente HDL funzione saggi27,28. Questo test è stato ulteriormente affinato e standardizzato nel nostro laboratorio in modo che può essere utilizzato in modo affidabile negli studi umani su larga scala anche con crioconservati plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive della malattia cardiovascolare, l’infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. qui, Descriviamo questo metodo semplice, ma robusto per misurare il contenuto di perossido lipidico di HDL (HDLox). Questo test utilizzabile come strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana dove l’infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l’aterosclerosi)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui offre un robusto strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nell’aterosclerosi e nella malattia umana. Il dosaggio quantifica il contenuto di perossido lipidico HDL per mg di HDL-C usando amplificazione enzimatica (HRP). Questo approccio evita limitazioni note di saggi per la funzione di HDL preventiva (ad es. il saggio di efflusso di colesterolo) tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizza…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro del Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. T.A.A. è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. AJ e AH sono supportati da NHMRC progetto grant 1108792. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
Riferimenti
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein–the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL–an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van’t Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
