Регенерация выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в реальном времени ячейки
Summary
Этот протокол описывает общую стратегию, для повторного создания коммерческих выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для метки бесплатный мобильный анализатор, направленных на экономию на высокой работает на основе ofmicrochip анализов затрат. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг, который позволяет повторное использование микросхем включает в себя процесс регенерации.
Abstract
Этикетка бесплатно на основе ячеек пробирного выгодно для биохимического исследования из-за него не требует использования экспериментальных животных. Из-за его способности предоставлять более динамичной информации о клетки в физиологических условиях, чем классическая биохимических анализов этот assay лейбл бесплатно реального времени клетки, основанного на принципе электроимпедансной привлекает больше внимания в течение последних десятилетия. Однако его практического использования могут быть ограничены из-за относительно высокой стоимостью измерения, в котором дорогостоящих расходных одноразовых золотые микросхемы используются для анализатор клеток. В этом протоколе мы разработали общую стратегию для регенерации выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в коммерческих лейбл свободных клеток. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг включает в себя процесс регенерации. Предложенный метод был испытания и показали свою эффективность для регенерации и повторного использования коммерческих электронных плит по крайней мере три раза, который поможет исследователям сохранить на высокой стоимости работает в реальном времени клеток.
Introduction
Из-за его эффективное и менее трудоемкий процесс экспериментальной лейбл свободной ячейки-технологии на основе стал свидетелем быстрого роста за последнее десятилетие в целях как аналитической, так и отбора таких как в аспекте протеомики1,2 , препарат доставки3, и т.д.4,5 по сравнению с традиционными биохимических методов, направленных на анализ клеток, assay этикетка бесплатно реального времени клетки с прототип, разработанный Giaever и coworkers ранее6 основана на принципе регистрации изменений электрического сигнала на поверхности клеток придает микрочипы, которые допускают непрерывного измерения роста клеток или миграции в количественном выражении. Следуя этой стратегии был запущен в реальном времени ячейки электронной зондирования (RT-КЕС) системы, используя принцип электрическое сопротивление на основе обнаружения был представлен7,8 и совсем недавно коммерческой реального времени ячейки анализатор (RTCA) для лабораторных исследований9.
Главным образом, коммерческие реального времени ячейки анализатор считывает клеток вызвали сигналы электрического сопротивления, которые приводят к от физиологических изменений инкубирован клеток, включая пролиферацию клеток, миграции, жизнеспособность, морфология и соблюдение на поверхность микросхемы,1011. Такие электрические сигналы далее преобразуются Безразмерный параметр с именем индекса ячейки (CI) для оценки состояния ячейки в анализатор. Изменение сопротивления микросхемы отражает главным образом местных ионных окружающей среды покрыты клеток в интерфейсе электрода/решения. Таким образом аналитическая производительность анализатор клеток полагается на ядро зондирования блок, одноразовые микросхемы (то есть, так называемые электронные пластины, например, 96/16/8-Ну), изготовленные из выстроились золото микроэлектродов lithographically печать в нижней части скважины инкубации. Золото микроэлектродов собрать в формате круг на линия (рис. 1) и покрывают большую часть площади поверхности инкубации скважин, которые позволяют для обнаружения динамических и чувствительных прилагаемый клетки3,12,13 ,14. CI увеличит в случае более поверхности покрытия клеток на чипе и уменьшаться, когда клетки подвергаются токсикант, что приводит к апоптозу. Хотя анализатор реального времени клетки часто использовался для определения цитотоксичность11 и нейротоксичность15 и предоставить больше кинетическая информации, чем классическая конечных точек метод, одноразовые электронные пластины являются дорогостоящая Расходные материалы.
До сих пор были не доступны методы для регенерации электронных пластины, которая, вероятно, объясняется тем, что суровые регенерации условия, такие как пираньи решения или уксусной кислоты являются участие16,17, 18, которые могут изменить состояние электрических золотые микросхемы. Таким образом мягкий и эффективный метод для удаления адэрентных клеток и других веществ с поверхности золотые фишки будет желательным для процесса регенерации электронных пластины. Мы недавно разработали протокол, направленный на регенерацию одноразовых электронных плит с использованием неагрессивных реагентов и регенерированный фишки характеризовались электрохимический, а также оптические методы19. С помощью легко доступных и умеренные лабораторных реагентов, включая трипсина и этанола, мы создали общий метод для повторного создания коммерческих электронных пластину без побочных эффектов, который успешно применяется для регенерации два основных типа электронные пластины (16 и L8) используется для RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы кратко несколько доступных методов17,23,24,25,26 для регенерации микросхемы в таблице 1. В основном эти методы участвует относительно суровые экспериментальных условий для достижения полно?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана национальной естественных наук фонд Китая (U1703118), проект, финансируемый приоритет академической программы развития из Цзянсу высшее образование учреждений (PAPD), Цзянсу Shuangchuang программы, открытые фонды государственного ключа Лаборатория для химиотерапии/Biosensing и хемометрике (2016015) и национальной лаборатории биомакромолекулах (2017kf05) и профессор Jiangsu Specially-Appointed проекта, Китай.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Riferimenti
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
