Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real
Summary
Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.
Abstract
O ensaio de baseada em célula livre de rótulo é vantajoso para estudos bioquímicos por causa disso não requer o uso de animais experimentais. Devido à sua capacidade para fornecer informações mais dinâmicas sobre células sob condições fisiológicas do que ensaios bioquímicos clássicos, este ensaio de célula livre de rótulo em tempo real com base no princípio da impedância elétrica está atraindo mais atenção durante o passado década. No entanto, sua utilização prática pode ser limitada devido ao custo relativamente caro de medição, no qual caro consumível descartável ouro “microchips” é utilizados para o analisador de célula. Neste protocolo, temos desenvolvido uma estratégia geral para regenerar a matriz microeletrodos ouro equipados para um analisador de célula livre de etiqueta comercial. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, lavagem com etanol e água e uma etapa de fiação. O método proposto foi testado e demonstrou ser eficaz para a regeneração e o uso repetido de placas eletrônicas comerciais pelo menos três vezes, que ajudará pesquisadores salvar sobre o alto custo de execução dos ensaios de celular em tempo real.
Introduction
Devido ao seu eficiente e menos trabalhoso processo experimental, tecnologia livre de etiqueta baseada em célula tem testemunhado o rápido crescimento na última década para fins analíticos, bem como seleção, tais como no aspecto da proteômica1,2 , drogas entrega3, etc.4,5 comparado com métodos bioquímicos tradicionais destinadas a análise de células, ensaio de pilha rótulo livre em tempo real com o protótipo desenvolvido pela Giaever e colegas de trabalho anteriormente6 é baseado no princípio de gravar alterações de sinal elétrico na superfície da célula-anexado microchips, que permitem uma medição contínua de crescimento celular ou migração de forma quantitativa. Seguindo esta estratégia, foi lançado um celular em tempo real eletrônico de sensoriamento sistema (RT-CES) usando o princípio de detecção baseada em impedância elétrica foi introduzido7,8 e, mais recentemente, um analisador de comercial celular em tempo real (RTCA) para o laboratório de pesquisa9.
O analisador de celular em tempo real comercial principalmente lê sinais evocados das células de impedância elétrica, que resultam as alterações fisiológicas das células incubadas incluindo proliferação celular, migração, morfologia, viabilidade e aderência sobre a superfície de “microchips”10,11. Esses sinais elétricos são convertidos mais pelo analyzer em um parâmetro adimensional denominado índice célula (CI) para avaliar o estado da célula. A mudança da impedância de microchips reflete principalmente o ambiente local iônico das células cobertos na interface eletrodo/solução. Portanto, o desempenho analítico do analisador célula depende muito a unidade de sensoriamento de núcleo, os microchips descartáveis (i.e., chamadas placas eletrônicas, por exemplo, 96/16/8 poços), que são feitos de microeletrodos matriz de ouro Litograficamente, impresso no fundo dos poços de incubação. Os ouro microeletrodos montam em um formato de círculo-on-line (Figura 1) e cobrem a maior parte da superfície dos poços de incubação, que permitem a detecção dinâmica e sensível de células anexado3,12,13 ,14. O CI aumentará no caso mais cobertura de superfície de células no chip e diminuir quando as células estão expostas a uma toxicidade resultando em apoptose. Embora o analisador em tempo real da célula tenha sido usado com frequência para determinar a citotoxicidade11 e neurotoxicidade15 e fornecer mais informações cinéticas do método clássico de pontos de extremidade, as placas eletrônicas descartáveis são as mais caras consumíveis.
Até agora, não houve nenhum método disponível para a regeneração da placa eletrônica, que é provavelmente devido ao fato de que as condições de regeneração dura, tais como solução de piranha ou ácido acético são envolvidos16,17, 18, que podem alterar o elétrico de microchips de ouro. Portanto, um método eficiente e suave para remover as células aderentes e outras substâncias da superfície dos chips de ouro será desejável para o processo de regeneração da placa eletrônica. Recentemente desenvolvemos um protocolo que visa a regeneração de descartáveis placas eletrônicas utilizando reagentes não-corrosivo e os chips regenerados foram caracterizados por métodos eletroquímicos, bem como óptico19. Ao utilizar reagentes de laboratório prontamente disponível e moderado, incluindo tripsina e etanol, temos estabelecido um método geral para regenerar a placa eletrônica comercial sem efeitos adversos, que é aplicada com sucesso para os dois tipos principais de regenerar da placa eletrônica (16 e L8) usaram para RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estamos resumidos diversos métodos disponíveis17,23,24,25,26 para regenerar microchips no quadro 1. Basicamente, esses métodos envolveram relativamente duras condições experimentais para alcançar a regeneração completa de chips por causa da presença de interações de molécula-molécula forte como a do complexo imune usado para chips…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (U1703118), um projeto financiado pela prioridade acadêmica programa desenvolvimento de Jiangsu ensino superior instituições (aqui), programa de Jiangsu Shuangchuang, fundos abertos da chave do estado Laboratório de quimioterapia/Biosensing Quimiometria (2016015) e o laboratório nacional de macromoléculas (2017kf05) e Professor de Jiangsu Specially-Appointed projeto, China.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Riferimenti
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
