Rigenerazione di microelettrodi oro allinearono attrezzata per un analizzatore in tempo reale delle cellule
Summary
Questo protocollo descrive una strategia generale per rigenerare microelettrodi oro allinearono commerciali attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta finalizzato al risparmio sull’alta analisi di ofmicrochip-based di costi in esecuzione. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura, che consente l’utilizzo ripetuto di microchip.
Abstract
Il dosaggio di basati su cellule privo di etichetta è vantaggioso per lo studio biochimico a causa di esso non richiede l’uso di animali da esperimento. Grazie alla sua capacità di fornire informazioni più dinamici sulle celle in condizioni fisiologiche più classiche analisi biochimiche, questo saggio di cellulare privo di etichetta in tempo reale sulla base del principio di impedenza elettrica sta attirando l’attenzione di più nel corso degli ultimi decennio. Tuttavia, la sua utilizzazione pratica può essere limitata a causa del costo relativamente costoso di misura, in cui vengono utilizzati microchip oro monouso consumabile costosa per l’analizzatore di cella. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una strategia generale per rigenerare allinearono microelettrodi oro attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta commerciale. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura. Il metodo proposto è stato testato e dimostrato di essere efficace per la rigenerazione e l’uso ripetuto di piastre elettroniche commerciali almeno tre volte, che aiuterà i ricercatori Risparmia sull’alto costo in esecuzione di analisi in tempo reale delle cellule.
Introduction
Grazie alla sua efficiente e meno laborioso processo sperimentale, tecnologia privo di etichetta cell-based ha assistito a rapida crescita nell’ultimo decennio per scopi analitici, nonché lo screening come sotto l’aspetto della proteomica1,2 , droga consegna3, ecc.4,5 confronto con metodi biochimici tradizionali finalizzato all’analisi di cellule, analisi delle cellule privo di etichetta in tempo reale con il prototipo sviluppato da Giaever e colleghe precedentemente6 si basa sul principio della registrazione delle modifiche di segnale elettrico sulla superficie della cella associata microchip, che consentono una misurazione continua della crescita delle cellule o la migrazione in maniera quantitativa. Seguendo questa strategia, è stato lanciato un cellulare in tempo reale (RT-CES) sistema utilizzando il principio di rilevamento basati su impedenza elettrica è stato introdotto7,8 e, più recentemente, un analizzatore di commerciale in tempo reale delle cellule (RTCA) di rilevamento elettronico per laboratorio ricerca9.
L’analizzatore di cellulare in tempo reale delle imprese principalmente legge segnali evocati delle cellule di impedenza elettrica, che derivano da cambiamenti fisiologici delle cellule incubate tra cui proliferazione, migrazione, vitalità, morfologia e aderenza sul superficie di microchip10,11. Tali segnali elettrici sono ulteriormente convertiti dall’analizzatore in un parametro adimensionale chiamato l’indice di cella (IC) per valutare lo stato delle cellule. La variazione dell’impedenza di microchip riflette principalmente l’ambiente ionico locale delle cellule coperte all’interfaccia elettrodo/soluzione. Di conseguenza, le prestazioni analitiche dell’analizzatore delle cellule si basa principalmente sull’unità di rilevamento di nucleo, i microchip usa e getta (cioè, cosiddetti piastre elettroniche, ad esempio, 96/16/8 pozzetti), che sono fatti di microelettrodi oro disposti litograficamente stampato in fondo dei pozzetti di incubazione. L’oro microelettrodi assemblare in un cerchio-su-linea formato (Figura 1) e coprono la maggior parte della superficie dei pozzetti di incubazione, che consentire il rilevamento dinamico e sensibile di cellule allegate3,12,13 ,14. CI sarà nel caso di copertura più superficiale delle cellule sul chip, quando aumentano e diminuiscono le cellule sono esposte a un tossico conseguente apoptosi. Anche se l’analizzatore in tempo reale delle cellule è stato spesso utilizzato per determinare la citotossicità11 e neurotossicità15 e fornire più informazioni cinetiche di metodo classico endpoint, le piastre elettroniche usa e gettare sono il più costoso materiale di consumo.
Fino ad ora, non ci sono stati nessun metodi disponibili per la rigenerazione della piastra elettronica, che è probabilmente dovuto al fatto che condizioni di rigenerazione dura, come soluzione piranha o acido acetico sono coinvolti16,17, 18, che possono alterare lo stato elettrico di microchip oro. Di conseguenza, un metodo delicato ed efficace per rimuovere le celle aderenti e altre sostanze dalla superficie di gettoni d’oro sarà desiderabile per il processo di rigenerazione di piastra elettronica. Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo volto alla rigenerazione delle piastre elettroniche monouso utilizzando reagenti non corrosivo e i chip rigenerati sono stati caratterizzati da metodi elettrochimici come pure ottico19. Utilizzando i reagenti di laboratorio prontamente disponibili e moderata tra cui tripsina ed etanolo, abbiamo stabilito un metodo generale per rigenerare la piastra elettronica commerciale senza effetti negativi, che è applicata con successo per rigenerare i due tipi principali della piastra elettronica (16 e L8) utilizzato per RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo riassunto diversi metodi disponibili17,23,24,25,26 per la rigenerazione di microchip nella tabella 1. Fondamentalmente, questi metodi coinvolti relativamente dure condizioni sperimentali per ottenere la completa rigenerazione dei chip a causa della presenza di interazioni molecola-molecola forte come quello del complesso immune per SPR…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (U1703118), un progetto finanziato dalla priorità accademico programma sviluppo di Jiangsu istruzione superiore istituzioni (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programma, fondi aperti della chiave dello stato Laboratorio per la chemio/biosensoristica e chemiometria (2016015) e il laboratorio nazionale di biomacromolecole (2017kf05) e professore di Jiangsu Specially-Appointed progetto, Cina.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Riferimenti
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
