Bereiding van de monsters voor de analyse van de Endopeptidomic van menselijke cerebrospinale vloeistof
Summary
Een methode voor massaspectrometrische analyse van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) wordt gepresenteerd. Door molecuulgewicht cut-off filtratie, chromatografische pre fractionering, massaspectrometrische analyse en een daaropvolgende combinatie van peptide identificatie strategieën, bleek het mogelijk om uit te breiden van de bekende CSF peptidome bijna tien keer in vergelijking naar eerdere studies.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode ontwikkeld om het identificeren van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF). Voor dit doel, een eerder ontwikkelde methode gebaseerd op moleculair gewicht cut-off (MWCO) filtratie en massaspectrometrische analyse werd gecombineerd met een off line high-pH omgekeerde fase HPLC pre fractionering stap.
Secretie in CSF is de belangrijkste route voor verwijdering van moleculen werpen door cellen van het centrale zenuwstelsel. Dus, veel processen in het centrale zenuwstelsel worden weerspiegeld in het CB, waardoor zij een waardevolle diagnostische vloeistof. CSF heeft een complexe samenstelling, die eiwitten bevatten die een concentratiebereik van 8-9 ordes van grootte beslaan. Naast eiwitten, hebben vorige studies ook aangetoond van de aanwezigheid van een groot aantal endogene peptiden. Terwijl minder uitgebreid bestudeerd dan eiwitten, kunnen deze ook potentieel belang houden als biomarkers.
Endogene peptiden werden gescheiden van het eiwitgehalte van CSF via MWCO filtratie. Door het verwijderen van een meerderheid van het eiwitgehalte van het monster, is het mogelijk om het monstervolume studeerde en daarmee ook het totale bedrag van de endogene peptiden. De complexiteit van het mengsel gefiltreerd peptide werd aangepakt door met inbegrip van een omgekeerde fase HPLC (RP) pre fractionering stap bij een alkalische pH vóór de LC-MS-analyse. De fractionering werd gecombineerd met een eenvoudige samenvoeging regeling waar 60 breuken werden gebundeld in 12, analyse tijd consumptie kon worden vermindert terwijl het nog steeds grotendeels vermijden co elutie.
Geautomatiseerde peptide identificatie werd uitgevoerd met behulp van drie verschillende peptide/eiwit identificatie softwareprogramma’s en de resultaten vervolgens te combineren. De verschillende programma’s werden aanvullende in plaats van vergelijkbaar met minder dan 15% van de identificaties overlappen tussen de drie.
Introduction
Biomarkers in cerebrospinale vloeistof (CSF) zijn momenteel onderzoek omzetten in neurodegeneratieve aandoeningen. In de ziekte van Alzheimer, de meest voorkomende neurodegeneratieve stoornis, die meer dan 60 miljoen mensen wereldwijd1,2, een biomarker triplet, bestaande uit de peptide bèta amyloid, microtubulus-stabiliseren eiwit tau, en een phosphorylated tau vorm, de ziekte kan detecteren met hoge gevoeligheid en specificiteit en is opgenomen in de criteria van het diagnostisch onderzoek3. In andere neurodegeneratieve ziekten, zoals Parkinson en Multiple sclerose, hebben proteomic studies vastgesteld talrijke biomerker kandidaten, waarvan sommige momenteel onder evaluatie in klinische studies4,5 zijn ,6.
Naast eiwitten bevat CSF ook een overvloed van endogene peptiden7,8,9,10,11,12. Splitsingsproducten van veel eiwitten van hersenen-afgeleide vormen, vertegenwoordigen deze peptiden ook een potentieel belangrijke bron van ziekte biomarkers. Verhogen van de inventaris van de geïdentificeerde endogene peptiden in menselijke CB en inschakelen van CSF endopeptidomic analyses in klinische studies, een methode ontwikkeld voor de bereiding van de monsters en LC-MS-analyse (een kort protocol-regeling is opgenomen in afbeelding 1 ). De toepassing van deze methode in een recente studie heeft geleid tot de identificatie van bijna 16,400 endogene CSF peptiden in samengevoegde CSF monsters van meerdere personen van niet-specifieke diagnose, uitbreiding van de bekende CSF endopeptidome tienvoudige13. De methode kan optioneel worden gebruikt in combinatie met isobaar etikettering aanpak voor kwantificering.
Bereiding van de monsters
De belangrijkste bron van eiwit massa van CB is plasma bestanddelen (bv albumine en immunoglobulinen) passeren over de bloed hersenen barrière14,15. Hun hoge overvloed belemmert de detectie van lage-overvloedig, hersenen-afgeleide monster onderdelen. Endogene peptiden kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de hoge-overvloedig eiwitten, waardoor een aanzienlijk grotere hoeveelheid CSF peptide extract te worden gebruikt bij LC-MS-analyse, zodat detectie van lagere-overvloedig peptiden.
In het protocol hier gepresenteerd, werd molecuulgewicht cut-off (MWCO) filtratie gebruikt voor het scheiden van de CSF peptiden van de eiwitoplossing; een methode die is gebruikt in verscheidene vorige studies8,9,10,11,12,16. De filtratie stap werd gevolgd door een off line RP HPLC pre fractionering stap uitgevoerd via een hoge-pH mobiele fase verloop. Door het uitvoeren van twee RP HPLC stappen in tandem, met pH wordt het belangrijkste onderscheid, resulteert het verschil in selectiviteit tussen de twee stappen hoofdzakelijk uit veranderde peptide retentie als gevolg van verschillende peptide gratis Staten. De toepassing van hoge-pH peptide pre fractionering vóór LC-MS onder zure omstandigheden heeft bewezen efficiënt bij het vergroten van de peptide identificatie17,18, en zelfs te zijn superieur voor dit doel in complexe biologische monsters in vergelijking met meer orthogonale scheiding modi19, zoals sterke cat-ion exchange (SCX) en RP20. Als u wilt verkorten analyse, werd een aaneenschakeling regeling gebruikt, bundeling van elke 12th breuk (b.v., breuken 1, 13, 25, 37 en 49), die als gevolg van de hoog oplossend vermogen van RP-HPLC nog steeds grotendeels vermeden co elutie van peptiden van verschillende breuken in de LC-MS stap20,21.
Peptide identificatie
Peptide identificatie in peptidomic studies verschilt van proteomic studies in dat geen enzym decolleté kan worden opgegeven in de database zoeken, en dientengevolge, identificatie tarieven meestal lager11 zijn. Een recente studie13 bleek dat de identificatie-tarieven voor endogene peptides verkregen met Sequest en mascotte waren aanzienlijk verbeterd wanneer de standaard scoren algoritme van de respectieve softwareprogramma is bewerkt met behulp van het adaptieve scoren algoritme Percolator, die aangeeft dat optimale scoren algoritmen voor endogene peptides van al peptiden13 afwijken. In die studie, identificatie op basis van automatische peptide DOVO sequencing met behulp van de software van de PIEKEN (BSI) bleek te zijn complementair aan de twee fragment ion vingerafdrukken gebaseerde zoekmachines, wat resulteert in een aanzienlijk groter aantal geïdentificeerd peptiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De invoering van een hoge-pH RP HPLC pre fractionering stap naar een eerder ontwikkelde protocol voor herstel van endogene peptiden door molecuulgewicht ultrafiltratie11 verminderd relatieve monster complexiteit en daardoor toegestaan voor een 5-voudig groter monstervolume worden bestudeerd. Dit, beurtelings, verhoogd de concentratie van de subset van peptides aanwezig in elke fractie en verbeterd waardoor de kans op detectie van lage overvloedige peptiden.
Door het uit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Veel dank aan Tanveer Batth en collega’s voor advies bij het opzetten van de pre fractionering methode.
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Zweedse Onderzoeksraad, de Wallström en Sjöblom Foundation, het pistool en Bertil Stohne Stichting Stiftelse, de Magnus Bergwall Stichting, de Stichting Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stichting för Gamla Tjänarinnor, Knut en Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen en FoU-provincie Västra Götalandsregionen.
De belangrijkste ontvangers van financiering van dit project waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg en Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
Riferimenti
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
