إعداد نموذج لتحليل اندوبيبتيدوميك في السائل الدماغي النخاعي البشرية
Summary
وتقدم طريقة للتحليل الشامل والمطيافيه من الببتيدات الذاتية في الإنسان السائل الدماغي النخاعي (CSF). عن طريق استخدام الترشيح النهائي الوزن الجزيئي والتحليل الشامل والمطيافيه والكروماتوغرافي وجود قبل تركيبة لاحقة من الببتيد تحديد الاستراتيجيات، كان من الممكن توسيع بيبتيدومي الخدمات القطرية المعروفة تقريبا عشرة إضعاف مقارنة للدراسات السابقة.
Abstract
هذا البروتوكول وصف أسلوب وضع تحديد الببتيدات الذاتية في الإنسان السائل الدماغي النخاعي (CSF). لهذا الغرض، أسلوب المتقدمة سابقا استناداً إلى الترشيح النهائي (موكو) الوزن الجزيئي والتحليل الشامل والمطيافيه كان جنبا إلى جنب مع خطوة ما قبل وجود [هبلك] حاليا مرحلة عكس درجة الحموضة العالية.
إفراز في السائل الدماغي النخاعي هو الطريق الرئيسي لإزالة الجزيئات يلقي بخلايا الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي، العديد من العمليات في الجهاز العصبي المركزي تتجلى في الخدمات القطرية، جعلها سائل تشخيصية قيمة. وقد CSF تركيبة معقدة، تحتوي على البروتينات التي تمتد عبر تركيز يتراوح بين 8-9 من حيث الحجم. بالإضافة إلى البروتينات، كما بينت الدراسات السابقة أن وجود عدد كبير من الببتيدات الذاتية. بينما تدرس على نطاق واسع أقل من البروتينات، وهذه قد تعقد الفائدة المحتملة كالمؤشرات الحيوية.
تم فصل الببتيدات الذاتية من محتوى البروتين السائل النخاعي عن طريق الترشيح موكو. عن طريق إزالة معظم محتوى البروتين من العينة، فمن الممكن زيادة حجم عينة الدراسة، وذلك أيضا المبلغ الإجمالي من الببتيدات الذاتية. وتناول تعقيد الخليط الببتيد فيلتراتيد بما في ذلك مرحلة عكس الخطوة ما قبل وجود [هبلك] (RP) على درجة الحموضة القلوية قبل تحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. تم تجزئة جنبا إلى جنب مع مخطط تسلسل بسيط حيث تم تجميع الكسور 60 إلى 12، يمكن وبالتالي تخفيض استهلاك الوقت تحليل بينما لا يزال إلى حد كبير تجنب شطف المشارك.
وأجرى التعرف الآلي الببتيد باستخدام ثلاثة مختلفة الببتيد/البروتين تحديد البرامج وبعد ذلك الجمع بين النتائج. وكانت مختلف برامج متكاملة بدلاً من أن تكون قابلة للمقارنة مع أقل من 15% الجثث تتداخل بين الثلاثة.
Introduction
المؤشرات الحيوية في السائل الدماغي النخاعي (CSF) هي حاليا تحويل البحوث إلى اضطرابات الأعصاب. في مرض الزهايمر، اضطراب الأعصاب الأكثر شيوعاً، التي تؤثر على ما يزيد على 60 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1،2، الثلاثي العلامات البيولوجية تتكون من بيتا اميلويد الببتيد، استقرار microtubule البروتين تاو، فوسفوريلاتيد تاو النموذج ويمكن الكشف عن المرض بحساسية عالية وخصوصية، وقد أدرجت في المعايير التشخيصية للبحث3. في أمراض الأعصاب الأخرى، مثل مرض باركنسون والتصلب المتعدد، وحددت الدراسات البروتين العديد من المرشحين العلامات البيولوجية، بعض التي حاليا قيد التقييم في الدراسات السريرية4،5 ،6.
جنبا إلى جنب مع البروتينات، يتضمن الخدمات القطرية أيضا وفرة من الببتيدات الذاتية7،،من89،10،،من1112. تشكل منتجات انشقاق العديد من البروتينات المشتقة من الدماغ، هذه الببتيدات أيضا تمثل مصدرا مهما محتملاً المرض المؤشرات الحيوية. لزيادة مخزون الببتيدات الذاتية التي تم تحديدها في الخدمات القطرية البشرية وتمكين تحليل السائل الدماغي النخاعي اندوبيبتيدوميك في الدراسات السريرية، ووضعت طريقة إعداد العينة وتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد (مخطط موجز بروتوكول قد أدرج في الشكل 1 ). تطبيق هذا الأسلوب في دراسة أجريت مؤخرا أسفرت عن تحديد هوية حوالي 16,400 الببتيدات الخدمات القطرية الذاتية في عينات السائل الدماغي النخاعي المجمعة من عدة أفراد من التشخيص غير محددة، وتوسيع اندوبيبتيدومي الخدمات القطرية المعروفة عشرة إضعاف13. يمكن استخدام الأسلوب اختيارياً بالاقتران مع نهج الوسم إيسوباريك للقياس الكمي.
إعداد نموذج
المصدر الرئيسي لكتلة البروتين في السائل النخاعي مكونات البلازما (مثل الزلال والمناعية) يمر عبر الدم الدماغ حاجز14،15. وفرة عالية يعوق الكشف عن مكونات العينة منخفض وفيرة، والمستمدة من الدماغ. الببتيدات الذاتية يمكن فصلها بسهولة عن البروتينات عالية وفيرة، مما يسمح لكمية أكبر بكثير من استخراج الببتيد CSF لاستخدامها لتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد، مما يمكن من اكتشاف الببتيدات أقل وفرة.
وفي البروتوكول المعروضة هنا، استخدمت الترشيح النهائي (موكو) الوزن الجزيئي لفصل السائل الدماغي النخاعي الببتيدات من الكسر البروتين؛ أسلوب الذي تم استخدامه في السابق عدة دراسات8،،من910،11،،من1216. وأعقب خطوة الترشيح خطوة ما قبل وجود البرنامج العادي [هبلك] دون اتصال يقوم على تدرج مرحلة متنقلة عالية-الأس الهيدروجيني. عن طريق إجراء خطوتين RP [هبلك] جنبا إلى جنب، مع درجة الحموضة ويجري التمييز الرئيسي، نتائج الفرق بين الخطوتين التاليتين في الانتقائية أساسا من الاحتفاظ الببتيد غيرت نتيجة تهمة الببتيد مختلف الدول. التطبيق قبل وجود الببتيد درجة الحموضة العالية قبل LC-MS تحت الظروف الحمضية أثبتت كفاءة في زيادة تحديد الببتيد،من1718، وحتى أن تكون متفوقة لهذا الغرض في البيولوجية المعقدة عينات بالمقارنة مع أكثر فصل متعامد وسائط19، مثل تبادل أيون القط قوية (SCX) والبرنامج العادي20. لتقصير فترة التحليل، تم استخدام مخطط تسلسل، تجمع كل 12th الكسر (مثلاً، الكسور 1, 13, 25 و 37 و 49)، الذي لا يزال إلى حد كبير تجنب شطف المشارك من الببتيدات من مختلف نظراً لارتفاع قوة حل للبرنامج العادي [هبلك] الخطوة الكسور في مرض التصلب العصبي المتعدد LC20،21.
تحديد الببتيد
تحديد الببتيد في الدراسات بيبتيدوميك تختلف عن تلك الدراسات البروتين حيث يمكن تحديد لا انشقاق الإنزيم في البحث عن قاعدة البيانات، ونتيجة لذلك، يتم تحديد أسعار عادة ما تكون أقل من11. وأظهرت دراسة الأخيرة13 أن معدلات تحديد الهوية الذاتية الببتيدات التي تم الحصول عليها مع سيكويست والتميمة إلى حد كبير تحسنت عند تعديل الافتراضي التهديف خوارزمية للبرنامج كل منهما استخدام التهديف التكيفية خوارزمية دورق القهوة، مما يشير إلى أن الخوارزميات التهديف الأمثل الببتيدات الذاتية تختلف من الببتيدات تريبتيك13. حيث تم العثور على الدراسة، وتحديد الهوية استناداً إلى تسلسل حيثياته الببتيد التلقائي باستخدام البرمجيات قمم (BSI) تكون مكملة لمحركات البحث على أساس أخذ بصمات أيون يفتت اثنين، أسفر عن مجموعة أكبر بكثير من تحديد الببتيدات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأخذ بخطوة ما قبل وجود RP [هبلك] درجة الحموضة العالية لبروتوكول المتقدمة سابقا لانتعاش الببتيدات الذاتية بالوزن الجزيئي أولترافيلتريشن11 تخفيض تعقيد العينة النسبي ومما يسمح لإضعاف أكبر حجم عينة الدراسة. هذا، بدوره، زيادة تركيز مجموعة فرعية الببتيدات موجودة في كل جزء وبالتال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جزيل الشكر باتث فاقد أحبابه وزملائه لتقديم المشورة في إعداد أسلوب تجزئة قبل.
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مجلس البحوث السويدية ولستروم ومؤسسة Sjöblom، البندقية وبيرتل ستون مؤسسة ستيفتيلسي، ومؤسسة بيرجوال ماغنوس، مؤسسة Åhlén، الزيميرفوندين، Demensförbundet، ستيفتيلسين Tjänarinnor جاملا كنوت ومؤسسة والنبرغ أليس، فريموراريستيفتيلسين، و Götalandsregionen FoU-فنادق.
وكانت المتلقية الرئيسية لتمويل هذا المشروع بلينو كاي، هنريك زعتربيرج ويوهان جوبوم.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
Riferimenti
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
