AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Физические принципы, лежащие в основе биомеханических контроля морфогенетических процессов являются во многом неопределенными. Хотя биомеханических исследований на молекулярном и клеточном уровне собирают значительный импульс, исследованию биомеханических параметров на уровне ткани/организм находится в зачаточном состоянии. Гидродинамические регрессии¹ или видео силу микроскопии² позволяют исследователям различать активные и пассивные силы, во время лазерной микрохирургии³или менее навязчивым атомно-силовой микроскопии (АСМ) диссоциированных клетки⁴ или в естественных условиях ⁵ или наночастиц микрореологию⁶ позволяют в преддверии механических свойств ткани и ответы.

AFM является трехмерных топографических техника с высоким разрешением атомной, шероховатости поверхности и соблюдение от отклонения кантилевера советы после контакта поверхности исследуемого⁷. Различные методики, используя AFM были разработаны для изучения свойств поверхности, включая измерения трения, силы сцепления и вязкоупругие свойства различных материалов. Недавно AFM стала мощным инструментом для получения информации о механических свойствах биологических образцов. В частности AFM неинвазивно можно извлечь модуль сдвига комплекс из единичных клеток путем применения колебательных отступы с микро Совет придает консольные известных изгиб постоянной⁸. Это позволяет нам выводить результирующие силы. Тем не менее, АСМ не является уникальным и разные методики позволяют извлечение данных реологических и механические свойства из отдельных клеток (например, микропипеткой стремление⁹магнитные скручивания цитометрии (MTC)¹⁰, или Одноосное растяжение Тестирование¹¹).

Тем не менее применение этих новых методологий для сложных морфогенетических процессов не проста. Основные проблемы при определении механических свойств эмбриональных тканей являются малые (мкм до мм), мягкие (в 10² – 10-⁴ ПА диапазона) и вязко упругие (приводящее к возникновению явлений время зависимых) характер материала¹². Поэтому важно адаптировать методы, используемые для определения механических свойств (жесткость, вязкость, адгезия) в конкретном случае эмбрионы и развивающихся организмов. Два важных вопросов необходимо учитывать при анализе реологических подходы к изучению развития: чтобы избежать навязчивой вмешательства и обеспечить доступность. В этом случае микропипеткой аспирации, MTC и испытания на растяжение выставлять ограничения. В первом случае высокой деформации, что страдает ячейки могут изменить его физиологические и механические свойства⁹. Во втором случае необходимо твердо придерживаться экспериментальной ткани к подложке для обеспечения, что подчеркивает применяется деформироваться цитоскелета локально предусмотреть также воздействие на состояние активации клеток и, следовательно, их механические характеристики¹⁰ . Последний, Одноосное растяжение подходов ограничиваются геометрии развивающихся организмов и доступность¹¹.

AFM, кажется, быть лучше подходят для изучения процессов развития, как изучение биологических образцов позволяет непосредственно в их естественной среде без каких-либо обременительных пробоподготовки. Кроме того как диссоциации эмбриональных тканей как правило, трудно, уменьшение размера АСМ зондов обеспечивает высокую степень универсальности без ограничения в выборе типа среднего (водный или безводным), температура образца или химического состав выборки. AFM достаточно универсален, чтобы применяться в больших доменах и времени весы и был нанят для извлечения свойств материала тканей в различные этапы развития или физиологических условиях. Всей родной тканей такие как артерий¹³ или кости¹⁴ были изучены с точки зрения топографических и в некоторых случаях, как склеры, механические свойства были также проверено¹⁵. Топография была также изучена в живой эмбрионов, позволяя визуализации, например, клетки перегруппировки в ходе морфогенеза в Xenopus¹⁶. Последние, всеобъемлющие образца подготовка протоколов были разработаны для определения механических параметров в ходе различных процессов развития. Наноиндентирование карты были созданы на родной незаписанных тканей секции для Чик эмбриональных пищеварительного тракта¹¹; клей и механических свойств, извлекаемых для отдельных ячеек прародитель эктодермы, мезодермы и энтодермы изолированы от gastrulating zebrafish эмбриона⁴; жесткость измерений для Эпибласт и примитивных полоска на эксплантов от птичьего эмбрионов¹⁷; и собственный шаблон жесткость градиенты непосредственно определен в эмбриональных мозга Xenopus⁵.

Значительный качественный скачок для применения AFM для изучения развития эмбриона может исходить от приближается к простой доступной морфогенетических процессов. Данио рерио epiboly является важным и сохраняется событие, в котором различные ткани координировать в ограниченном пространстве сферических прямого расширения бластодермы в течение нескольких часов. В начале данио рерио epiboly (сферические этап) поверхностный слой клеток, обволакивающий слой (EVL), охватывает полусферических Кап бластомеров сосредоточены на животное полюс сидя на массивных желток-синцитиальный клеток эмбриона. Epiboly состоит из кортикального слоя растительного Уорд расширения EVL, глубокие клетки (DCs) бластодерма, и наружный слой клеток-синцитиальный желток (E-YSL) вокруг желтка. Epiboly концы с закрытием EVL и DCs на^19,18,растительных полюса²⁰. Как и где силы создаются во время epiboly, и как они соединены в глобальном масштабе не ясно еще^1,21.

Здесь мы подробно описать как применять AFM заключить, что свойства пассивной механических тканей во время epiboly прогрессии в желтке данио рерио ячейки в естественных условиях. Сделать это, мы используем небольшие микросферы, придает AFM кантилеверы как зонды. Это позволяет поиск точных местной информации в пределах желток неоднородной поверхности клетки и учиться напряжённая градиентов и их динамику с течением времени. Альтернативные AFM подходы например, с использованием клин кантилеверы²², будет не визуализации локальных данных, который является достаточно точным. Клин технику, которая требует очень тщательного манипуляции навыки клеить клин больше, чем размер выборки в конце кантилевера, не хорошо подходит для исследования эмбриона (~ 2 раза больше, чем длина консольные) механика.

Моделирование и характеризующие вязкоупругие свойства клеток в качественном и количественном отношениях позволяет для более глубокого понимания их биомеханики. С биомеханической точки зрения важно, чтобы понять epiboly, а не только спрос знание корковых напряжения измерения и динамики, которые могут быть извлечены AFM; Таким образом, существует потребность в информации о биофизических свойствах ткани. Для получения этой информации, различных методов реологические свойства ячейки были разработаны с годами для характеристики различных типов клеток при различных физиологических условиях²³. Они включают в себя AFM, MTC и Оптический пинцет (OT). Эти методы, однако, как было доказано недостаточно для анализа мезоскопических в масштабе эмбрионов или органов. В качестве альтернативы мы успешно адаптировались⁶ наночастиц отслеживания микрореологию в vivo реологических измерений. Этот метод анализирует броуновского перемещений отдельных частиц и выводит местных микромеханические свойства.

Вместе AFM и наночастиц микрореологию позволяют определение динамики корковых растягивающих и внутренних механических свойств желток во время epiboly. Эта информация полностью поддерживает модель, в котором анизотропной стресс развивается вследствие различий в ответе деформации EVL и желток цитоплазматических слой (коммунистической) к сужению изотропной actomyosin E-YSL коры имеет важное значение для направленного движения чистой EVL и epiboly прогрессии¹.