AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

Les principes physiques qui sous-tendent le contrôle biomécanique des processus morphogénétiques sont en grande partie non définies. Alors que des études biomécaniques au niveau moléculaire et cellulaire sont rassemblent élan considérable, l’exploration des paramètres biomécaniques au niveau tissulaire/organisme est à ses balbutiements. Hydrodynamiques régression¹ ou vidéo microscopie de Force² permettent aux chercheurs de distinguer les forces actives et passives, tandis que de microchirurgie laser³, ou la moins intrusive microscopie à force atomique (AFM) de cellules dissociées⁴ ou en vivo ⁵ ou nanoparticules microrhéologie⁶ permettre l’anticipation d’un tissu propriétés mécaniques et les réponses.

AFM est une technique topographique en trois dimensions avec une haute résolution atomique résoudre la rugosité et la conformité de la déviation de conseils en porte-à-faux lors du contact avec une surface sondé⁷. Différentes méthodes employant l’AFM ont été développés pour étudier les propriétés de surface, y compris mesure de frottement, adhérence des forces et des propriétés viscoélastiques des matériaux diversifiés. Récemment, l’AFM a émergé comme un outil puissant pour récupérer des informations sur les propriétés mécaniques des échantillons biologiques. En particulier, AFM peut extraire non invasive le module de cisaillement complexe de cellules individuelles en appliquant des indentations oscillatoires avec un embout micro attaché au bras de levier du connu flexion constante⁸. Cela nous permet de déduire les forces qui en résultent. Pourtant, l’AFM n’est pas unique et différentes méthodologies permettent d’extraire des données rhéologiques et mécaniques de cellules individuelles (p. ex., Micropipette aspiration⁹, magnétique torsion cytometry (MTC)¹⁰ou uniaxiales traction essai¹¹).

Pourtant, l’application de ces nouvelles méthodes aux processus morphogénétiques complexes n’est pas simple. Les principaux défis rencontrés lors de la détermination des propriétés mécaniques des tissus embryonnaires sont les petits (µm à mm), doux (dans les 10² – 10⁴ Pa rang) et la nature visco-élastique (donnant lieu à des phénomènes dépendant du temps) de la matière¹². Il est donc important d’adapter les méthodes employées pour la détermination des propriétés mécaniques (rigidité, viscosité, adhérence) pour le cas spécifique des embryons et des organismes en développement. Deux questions importantes doivent être pris en considération lors de l’analyse rhéologiques approches pour étudier le développement : pour éviter toute interférence intrusive et de fournir un accès facile. Dans ce scénario, aspiration de micropipette, MTC et essai de traction présentent des limites. Dans le premier cas, la déformation importante qui souffre d’une cellule susceptible de modifier ses propriétés physiologiques et mécaniques⁹. Dans le second cas, la nécessité d’adhérer fermement le tissu expérimental à un substrat pour s’assurer que les contraintes appliquées déforment le cytosquelette localement pourrait également introduire des effets sur l’état d’activation des cellules et, par conséquent, dans leurs caractéristiques mécaniques¹⁰ . Dernières approches traction uniaxiales sont limitées par la géométrie de développer des organismes et accessibilité¹¹.

AFM semble mieux convenir pour l’étude des processus de développement car elle permet l’étude d’échantillons biologiques directement dans leur milieu naturel sans aucune préparation de l’échantillon encombrant. En outre, dissociation des tissus embryonnaires est généralement difficile, la taille réduite des sondes AFM fournit un haut degré de polyvalence sans limitation dans le choix du type de milieu (aqueuse ou non aqueuses), température de l’échantillon ou chimique composition de l’échantillon. AFM est suffisamment polyvalent pour être appliquée à vastes domaines et d’échelles de temps et a été employé pour récupérer les propriétés des matériaux des tissus dans des conditions physiologiques ou stades distincts. Les tissus ensemble natifs comme artères¹³ ou OS¹⁴ ont été étudiées d’un point de vue topographique et dans certains cas, comme la sclère, propriétés mécaniques ont également été consulté le¹⁵. Topographie a également été explorée dans les embryons vivants permettant la visualisation, par exemple, cellule du réarrangement d’au cours de la morphogenèse in Xenopus¹⁶. Protocoles de préparation témoin dernier, Global ont été développés afin de déterminer les paramètres mécaniques au cours de différents processus de développement. Cartes de nanoindentation ont été générées sur des sections de tissu non fixées natif pour le poussin embryonnaire tube digestif¹¹; propriétés adhésives et mécaniques Récupérée pour individuels ectoderme, mésoderme et endoderme progéniteurs isolés des embryons de poisson-zèbre gastrulating⁴; mesures de rigidité effectuées pour l’épiblaste et de la ligne primitive sur des explants d’embryons aviaires¹⁷; et une nette tendance de dégradés de rigidité définis directement dans le cerveau embryonnaire de Xenopus⁵.

Un saut qualitatif important d’application AFM pour explorer le développement embryonnaire peut-être provenir de l’approche simples processus morphogénétiques accessibles. Poisson zèbre épibolie est un événement essentiel et conservé, dans lequel les différents tissus coordonnent dans un espace restreint et sphérique de diriger l’expansion de la blastoderme en quelques heures. Dès l’apparition du poisson-zèbre épibolie (stade sphérique), une couche superficielle de cellules, la couche enveloppante (EVL), couvre un plafond semi-sphérique de blastomères centrée sur le pôle animal de l’embryon, assis sur une cellule syncytial massif jaune d’oeuf. Épibolie consiste en l’expansion corticale ward végétal de l’EVL, les cellules profondes (DCs) du blastoderme et la couche externe de la cellule de jaune de œuf syncytial (E-YSL) autour du jaune. Épibolie se termine par la fermeture de l’EVL et les contrôleurs de domaine à la pole vegetal^18,19,20. Comment et où les forces sont générés durant l’épibolie et comment ils sont couplés à l’échelle mondiale ne sont pas encore clair^1,21.

Ici, nous décrivons en détail comment appliquer AFM pour inférer les propriétés tissu mécanique passive au cours de la progression dans le poisson-zèbre jaune épibolie cellulaire in vivo. Pour ce faire, nous avons utilisé des microsphères petits attachés à encorbellements AFM comme sondes. Ceci permet la récupération d’informations locales précises au sein de la surface des cellules non uniforme jaune de œuf et d’étudier les gradients de tension et leur dynamique au fil du temps. AFM alternative approches telles que celles à l’aide de cale encorbellements²², sera rendu pas aux données locales qui sont assez précises. La technique du coin, qui exige des compétences de manipulation très prudent pour coller une cale plus grande que la taille de l’échantillon à l’extrémité du levier, n’est pas bien adaptée pour sonder l’embryon (~ 2 fois plus grande que la longueur du levier) mécanique.

Modélisation et à caractériser les propriétés viscoélastiques des cellules de façon qualitative et quantitative permet une meilleure compréhension de leur biomécanique. D’un point de vue biomécanique, il est essentiel de comprendre l’épibolie et pas seulement demande connaissance des mesures de tension corticale et dynamiques, qui peuvent être extraites par l’AFM ; ainsi, il y a besoin d’informations sur les propriétés biophysiques du tissu. Pour extraire ces informations, une variété de cellule rhéologie techniques ont été développés au cours des années afin de caractériser les différents types de cellules sous différentes conditions physiologiques²³. Citons, entre autres, AFM, MTC et pinces optiques (OT). Ces méthodes, cependant, ont fait leurs preuves insuffisantes pour mésoscopique des analyses à l’échelle d’embryons ou d’organes. Comme alternative, nous avons adapté avec succès les suivi des nanoparticules microrhéologie⁶ pour in vivo des mesures rhéologiques. Cette technique analyse les déplacements browniens des particules individuelles et déduit les propriétés locales micromécaniques.

Ensemble microrhéologie AFM et nanoparticules permettent la définition de dynamique corticale des ligatures et des propriétés mécaniques internes du jaune durant l’épibolie. Cette information souscrit pleinement à un modèle dans lequel les contraintes anisotropes se développe en raison des différences dans la réponse de déformation de l’EVL et la couche cytoplasmique de jaune d’oeuf (YCL) à la contraction de l’actomyosine isotrope du cortex E-YSL est essentielle pour le mouvement directionnel net de l’EVL et épibolie progression¹.