فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد
Summary
عدم وجود أدوات لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو يمنع التحقق من صحة أدوارهم أثناء التطوير. استخدمنا مجهر القوة الذرية (AFM) وتتبع نانوحبيبات لقياس الخصائص الميكانيكية على الخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. هذه الأساليب موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع تجنب التدخلات تطفﻻ.
Abstract
توضيح العوامل التي توجه المنظمة الزمانية المتطورة الأنسجة أحد الأغراض الرئيسية في دراسة التنمية. المقترحات المختلفة المطالبة كانت مساهمات هامة في فهم الخواص الميكانيكية للخلايا والأنسجة في منظمتهم الزمانية المكانية في العمليات الإنمائية ومورفوجينيتيك المختلفة. ومع ذلك، نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها ويمكن الوصول إليها لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو، التحقق من صحة هذه الفرضيات كانت صعبة. نقدم هنا أساليب استخدام مجهر القوة الذرية (AFM)، والجسيمات التي تتبع بهدف قياس الخواص الميكانيكية للخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. ابيبولي هو عملية إنمائية مصانة أوائل الدراسة الذي يسر بشفافية للجنين. هذه الأساليب بسيطة لتنفيذ وموثوق بها، والمطبقة على نطاق واسع نظراً للتغلب عليها تدخلي التدخلات التي يمكن أن تؤثر على الأنسجة الميكانيكا. تم تطبيق استراتيجية بسيطة لتركيب العينات وتسجيل فؤاد وحقن نانوحبيبات وتتبع. هذا النهج يجعل هذه الأساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أوقات الإنمائية أو الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
المبادئ المادية الأساسية لمراقبة النشاط الحيوي للعمليات مورفوجينيتيك إلى حد كبير غير معرف. في حين يتم جمع دراسات النشاط الحيوي على المستوى الجزيئي والخلوي زخما كبيرا، استكشاف معلمات النشاط الحيوي على مستوى الأنسجة/الكائن في مهدها. هيدرودينامية الانحدار1 أو “مجهرية القوة الفيديو”2 تسمح للباحثين التمييز بين القوات الإيجابي والسلبي، بينما الليزر الجراحة3أو أقل تطفﻻ مجهر القوة الذرية (AFM) من الخلايا ينتابها4 أو في فيفو ميكرورهيولوجي 5 أو نانوحبيبات6 تسمح تحسبا للخواص الميكانيكية للأنسجة والردود.
فؤاد أسلوب طبوغرافية ثلاثية الأبعاد مع ارتفاع القرار الذري حل خشونة السطح والامتثال من الانحراف نصائح ناتئ عند الاتصال مع سطح بروبيد7. تم وضع منهجيات مختلفة تستخدم فؤاد للتحقيق في خصائص السطح، بما في ذلك قياس خصائص لزج مطاطي من مواد متنوعة وقوى الالتصاق والاحتكاك. في الآونة الأخيرة، برز فؤاد كأداة قوية لاسترداد معلومات عن الخواص الميكانيكية للعينات البيولوجية. على وجه الخصوص، فؤاد غير إينفاسيفيلي استخراج معامل القص معقدة من الخلايا المفردة بتطبيق المسافات البادئة متذبذبة مع تلميح صغيرة تعلق على ناتئ معروفة ثابتة الانحناء/8. وهذا يتيح لنا استنتاج القوى الناتجة عن ذلك. فؤاد ليست فريدة من نوعها حتى الآن، ومنهجيات مختلفة تسمح لاستخراج بيانات انسيابية والخصائص الميكانيكية من الخلايا الفردية (مثلاً، ميكروبيبيتي تطلع9، المغناطيسية التواء الخلوي (MTC)10، أو أونياكسيال الشد اختبار11).
حتى الآن، تطبيق هذه المنهجيات الجديدة للعمليات المعقدة morphogenetic ليست واضحة. التحديات الرئيسية التي تواجه عند تحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية هي الصغيرة (ميكرومتر إلى ملم)، ناعمة (في 102 -نطاق السلطة الفلسطينية4 10) وطبيعة المواد12فيسكو-مطاطا (تؤدي إلى الظواهر تعتمد على الوقت). ولذلك من المهم أن التكيف مع الأساليب المستخدمة لتحديد الخواص الميكانيكية (صلابة، واللزوجة، والالتصاق) إلى الحالة المحددة للأجنة والكائنات الحية النامية. قضيتين هامتين بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند تحليل النهج انسيابية لدراسة التنمية: تجنب التدخل تدخلا، وتوفير سهولة الوصول إليها. في هذا السيناريو، تظهر تطلع ميكروبيبيتي ولجنة النقل البحري، واختبار الشد القيود. ففي الحالة الأولى، قد يغير تشوه العالية التي يعاني خلية بالخصائص الفسيولوجية والميكانيكية9. وفي الحالة الثانية، يمكن أيضا إدخال الحاجة إلى الالتزام بشدة الأنسجة التجريبية إلى ركيزة لضمان أن يشدد على تطبيق تشوه cytoskeleton محلياً الآثار في حالة التنشيط للخلايا، ومن ثم، في تلك الميزات الميكانيكية10 . نهج آخر، أونياكسيال الشد مقيدة بهندسة تطوير الكائنات الحية وإمكانية الوصول إلى11.
فؤاد يبدو أن يكون أكثر ملاءمة لدراسة العمليات الإنمائية أنها تتيح دراسة عينات بيولوجية مباشرة في بيئتها الطبيعية دون أي تحضير العينة مرهقة. وعلاوة على ذلك، كما تفكك الأنسجة الجنينية من الصعب عموما، تخفيض حجم المجسات فؤاد يوفر درجة عالية من التنوع مع أي قيود في اختيار نوع المتوسطة (مائي أو غير مائي) أو درجة حرارة العينة الكيميائية تكوين العينة. فؤاد مرنة بما يكفي لتطبيقها على مجالات كبيرة والوقت جداول، وقد استخدمت لاسترداد خصائص المواد للأنسجة في مراحل تنموية متميزة أو الظروف الفسيولوجية. الأنسجة الأصلية كاملة مثل الشرايين13 أو العظام14 قد درست من وجهة نظر طوبوغرافية، وفي بعض الحالات، مثل الصلبة، الخواص الميكانيكية قد أيضا تم استرجاع15. كما تم استكشاف التضاريس في الأجنة الحية يسمح التصور من، على سبيل المثال، الخلية إعادة ترتيب خلال morphogenesis في النمو16. وقد وضعت نموذج آخر، شاملة إعداد بروتوكولات لتحديد معلمات الميكانيكية أثناء عمليات إنمائية مختلفة. خرائط نانويندينتيشن تم إنشاؤها في أقسام الأنسجة غير المثبتة الأصلي ل القناة الهضمية الجنينية الفرخ11؛ استرداد خصائص لاصقة والميكانيكية الأديم الظاهر، mesoderm، والأنسجة السلف خلايا فردية معزولة عن جاسترولاتينج الزرد الأجنة4؛ القيام بقياسات صلابة epiblast والانتصارات البدائية في اكسبلانتس من أجنة الطيور17؛ ونمط متميز من صلابة تدرجات معرفة مباشرة في الدماغ الجنينية للنمو5.
قد تأتي قفزة نوعية كبيرة لتطبيق فؤاد لاستكشاف التطور الجنيني من الاقتراب من العمليات البسيطة morphogenetic موجوداً. ابيبولي الزرد هو حدث أساسي ومصانة، التي تنسق أنسجة مختلفة في الفضاء كروية مقيدة لتوجيه التوسع بلاستوديرم في بضع ساعات. في بداية ابيبولي الزرد (مرحلة كروية)، تغطي طبقة سطحية من الخلايا، طبقة تغليف (EVL)، غطاء شبه كروية من blastomeres تتمحور حول القطب الحيواني الجنين يجلس على خلية المخلوي صفار ضخمة. ابيبولي يتكون من توسيع وارد نباتية القشرية EVL، الخلايا العميقة (DCs) في بلاستوديرم، والطبقة الخارجية للخلية صفار المخلوي (E-المساومة) حول الصفار. ابيبولي تنتهي مع الإغلاق في EVL ووحدات تحكم المجال Dc في القطب فيجيتال18،،من1920. كيف وأين يتم إنشاء القوات أثناء ابيبولي وكيف أنها تقترن على الصعيد العالمي ليس واضحا بعد1،21.
هنا نحن تصف بالتفصيل كيفية تطبيق فؤاد للاستدلال على خصائص الأنسجة الميكانيكية السلبي أثناء التقدم ابيبولي في الصفار الزرد الخلية في الجسم الحي. للقيام بذلك، استخدمنا الجزئي المجالات الخرز الصغير الصغيرة تعلق على كانتيليفيرس فؤاد كما يسبر. وهذا ما يسمح على استرجاع المعلومات المحلية دقيقة داخل سطح الخلية صفار غير موحدة ودراسة التدرجات المتوترة وديناميتها على مر الزمن. نهج فؤاد بديلة مثل أولئك الذين يستخدمون آسفين cantilevers22، سوف لا تجعل البيانات المحلية التي دقيقة بما يكفي. تقنية آسفين، الذي يتطلب مهارات معالجة حذرة للغاية الغراء آسفين أكبر من حجم العينة في نهاية ناتئ، ليست مناسبة تماما لسبر الجنين (~ 2-fold أكبر من طول ناتئ) الميكانيكا.
يسمح النمذجة وتميز خصائص الخلايا لزج مطاطي في الطرق الكمية والنوعية لتحسين فهم على علم الميكانيكا الأحيائية. من وجهة نظر النشاط الحيوي، من الضروري فهم ابيبولي، وليس مجرد الطلب المعرفة على قياسات التوتر القشرية، وديناميات، التي يمكن أن تستخلص من فؤاد؛ وبالتالي هناك حاجة للحصول على معلومات حول الخصائص الفيزيائية-الحيوية للأنسجة. لاستخراج هذه المعلومات، قد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات ريولوجيا خلية على مر السنين لوصف أنواع مختلفة من الخلايا تحت ظروف فسيولوجية مختلفة23. وهي تشمل فؤاد، ولجنة النقل البحري، وملاقط بصرية (OT). هذه الأساليب، ولكن ثبت غير كافية للتحاليل mesoscopic بمقياس للأجنة أو أجهزة. وكبديل لذلك، نحن تكيفت بنجاح ميكرورهيولوجي نانوحبيبات-تتبع6 في فيفو القياسات انسيابية. هذا الأسلوب يحلل عمليات النزوح براونية الجزيئات الفردية، وتستدل على الخصائص المحلية ذبابة.
ميكرورهيولوجي فؤاد ونانوحبيبات معا يسمح تعريف ديناميات المتوترة القشرية وخواصها الميكانيكية الداخلية صفار البيض أثناء ابيبولي. ويؤيد هذه المعلومات نموذج الذي يطور متباين من الإجهاد نتيجة للاختلافات في رد التشوه EVL وصفار هيولى طبقة (يحتلون) إلى انكماش قشرة ه-ننصح أكتوميوسين الخواص ضروري حركة صافي اتجاهي ل التقدم EVL وابيبولي1.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نظهر أن خصائص المواد وبعض معلمات النشاط الحيوي للخلية صفار الزرد أثناء ابيبولي يمكن بسهولة تقدير قبل ميكرورهيولوجي فؤاد وجسيمات نانوية.
في حين قد استخدمت فؤاد لاسترداد السمات انسيابية للخلايا والأنسجة في الظروف الفسيولوجية4،5،…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر عمايرة هيرنانديز-فيغا، وفيليب ألكسندر بويي للمشاركة في إعداد الأساس لهذه البروتوكولات. ونشكر أيضا “منصة التصوير الجزيئي” من إيبمب-ثنائي الفينيل متعدد الكلور، واستبان كزافييه وأعضاء المختبر للدعم المستمر. وأيد “البرنامج الموحد مجموعات” محافظة كاتالونيا والإدارة و “تدعيم المنح المقدمة” من وزارة الاقتصاد والقدرة على المنافسة في إسبانيا للتطريز و DN هذا العمل.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Riferimenti
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
