Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Na Vivo Sinalização de dano do ADN não é bem compreendido.
In vivo, o DNA é complexed com histonas e outros fatores para fibras de cromatina de forma. Regulamento da estrutura da cromatina é de suma importância para o metabolismo do DNA. Por exemplo, a variante de histona H2AX é fosforilada por ataxia-telangiectasia mutado (ATM) e outras cinases seguintes da dobro-Costa quebra indução (DSB) e é importante para a amplificação de sinal DSB danos, bem como fornecendo um site encaixe para outro fatores. Propagação de escolha de caminho de sinalização e reparação de danos aparecem criticamente ser influenciada pela estrutura da cromatina local em danos locais¹. Um número de cromatina remodelação fatores acompanhantes de histona e histona modificando as enzimas na verdade são recrutados para danificar sites e são importante para o reparo de DNA eficiente, destacando a importância do Regulamento de cromatina no DDR e reparar^{2 , 3 , 4}. Além disso, site de danos de cluster ou reposicionamento foi observada em levedura e drosófila^5,6,7,8, uma reminiscência do relocalization dos loci de gene na compartimento de fracoes associado gene Regulamento^9,10. Estudos recentes no rato e células humanas também revelaram a mobilização dos sites DSB, que influências reparar fidelidade e caminho escolha^11,12. Isto levanta a possibilidade que DDR/reparação pode também ser intimamente ligada à arquitetura nuclear, organização de ordem superior da cromatina e cromossomo dinâmica no núcleo celular. Assim, é fundamental para desenvolver métodos de alta resolução para estudar DDR e processos no contexto do ambiente endógeno nuclear em uma célula viva de reparação a fim de compreender as consequências de curto e longo prazo de dano do ADN.

Papel crítico de PAR polimerase (PARP) para medir a extensão e o tipo de dano e regulamenta o Assembly de proteína no local do dano
PARP1 é um sensor de ADN nick rapidamente ativado por dano do ADN que desempenha um papel crítico no reparo de ADN¹³. PARP1 foi pensado originalmente para funcionar em conjunto com o x-ray reparação Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar o reparo de excisão de base (BER), mas estudos recentes revelam seu papel em outras vias de reparo do DNA, incluindo ORL reparação¹⁴. Ativado PARP1 usos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD⁺) como um substrato para ADP-ribosylate várias proteínas alvo, incluindo ele mesmo. Esta enzima e outros membros da família têm atraído muita atenção nos últimos anos como inibidores da PARP surgiram drogas terapêuticas tão promissoras para cancros. Embora inibidores da PARP inicialmente foram encontrados para ser eficaz no gene do cancro da mama (BRCA)-uma mutação de células de câncer de mama, existe agora uma pletora de evidências para seus efeitos em terapias de combinação e mono – juntamente com DNA prejudicial agentes/irradiação contra um amplo espectro de cancros com mutações, que não se limitando a BRCA^{15,16,17,18,19,20}.

A nível molecular, ativação de PARP mostrou desempenham um papel crítico na organização da estrutura da cromatina local em sites de danos. Recrutamento de PAR-dependente de enzimas de modificação de cromatina facilita a reparação de ORL e ditames reparar escolhas de caminho, sugerindo o papel de andaimes importantes de modificação do PAR em locais de dano. ¹³,^{21,22,23,24,25,26,},^{27,28,29, 30,31} recentemente Demonstramos a exclusão da proteína p53-1 (53BP1) de dano sites por PAR ³², fornecendo uma explicação alternativa para dependentes de 53BP1 hyperactivation de endjoining não-homóloga ( NHEJ) por PARP inibidor e destacando a importância do PARP em ORL reparação via escolha^33,34. PARP1 também diretamente PARylates e afeta a atividade da DNA vários reparos fatores¹⁴.

Usando o Laser Microirradiation como uma ferramenta para estudar a DDR/reparação na Vivo
Microirradiation do laser para produzir alterações sub mícron em cromossomos individuais foi primeiro descrita em 1969³⁵ e revisado em detalhes em 1981³⁶. Várias décadas mais tarde, microirradiation do laser foi mostrado para induzir dano de DNA em uma região submicrometer definido no núcleo celular e foi provado para ser uma técnica valiosa para o estudo de recrutamento ou modificações de vários fatores de lesões do ADN em vivo ^{13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41}. este método permite a detecção desses factores que não formam distintos focos induzida por irradiação (IRIF) em danos sites^39,42. Também é possível examinar a spatiotemporal dinâmica de alterações estruturais da cromatina em sítios de dano e no resto do núcleo. Comparamos com cuidado os DDRs induzidas por sistemas diferentes de laser e poderes para avaliar a relação entre o tipo de dano do ADN e o microirradiation condições^32,,^{43,44, de entrada 45}. Os padrões de recrutamento aberrante de 53BP1 e oligospermia repetir fator obrigatório 2 (TRF2) foram observados nos estudos anteriores de dano do laser, que forneceram a base para a recorrente preocupação com a natureza “não-fisiológica” de dano induzido por laser^{46 ,},^47,,^48,49. Nós achamos que estas aparentes discrepâncias agora poderiam ser explicadas pelo diferencial PARP sinalizando que mede a quantidade e a complexidade do dano induzido³². Nós confirmamos que: 1) do laser-microirradiated células (mesmo após irradiação de entrada-potência alta) são presos em interfase, de uma forma de controle-dependente de ponto de verificação de danos e permanecem viáveis (pelo menos até 48 h)^32,,⁵⁰; e 2) reparação fator recrutamento/modificações fielmente recapitular aqueles observados com tratamento com agentes prejudiciais de DNA convencionais e indução de ORL por endonucleases^{32,39,42, 44,50,},^51,52. Estes resultados suportam fortemente a relevância fisiológica de estudar a resposta celular induzida por danos de laser.