激光 Microirradiation 研究体内细胞对简单复杂 DNA 损伤的反应

在体内DNA 损伤信号不太清楚
在体内, DNA 与组蛋白和其他因素复合形成染色质纤维。染色质结构的调节对 DNA 代谢至关重要。例如, 组蛋白变体 H2AX 是由共济失调-扩张突变 (ATM) 和其他激酶后的双链断裂 (争端) 诱导磷酸化, 是重要的争端处理的损害信号放大, 以及提供一个对接地点的其他因素.损伤信号的传播和修复途径的选择似乎受到局部染色质结构的严重影响¹。一些染色质重塑因子, 组蛋白的陪护, 和组蛋白修饰酶确实被招募到破坏地点, 是重要的有效的 DNA 修复, 突出了染色质调节的意义在 DDR 和修复^2,3,4. 此外, 在酵母和果蝇^5,6,7,8中观察到的损伤站点聚类或重新定位, 让人联想到孵育的基因座与基因调控相关的层次室^9,10。最近在老鼠和人类细胞中的研究也显示了对争端修复点的动员, 这影响了维修保真度和路径选择^11,12。这就增加了 DDR/修复也可能与核结构、高阶染色质组织和细胞核内的染色体动力学紧密相连的可能性。因此, 必须发展高分辨率的方法, 以研究在活细胞内核环境的背景下的 DDR 和修复过程, 以便了解 DNA 损伤的短期和长期后果。

PAR 聚合酶 (PARP) 在测量损伤部位的损伤程度和类型以及调节蛋白质组装方面的关键作用
PARP1 是 dna 尼克传感器迅速激活 dna 损伤, 在 dna 修复¹³中扮演关键角色。PARP1 最初被认为与 X 射线修复交叉配合 1 (XRCC1), 以促进基础切除修复 (BER), 但最近的研究显示它的作用在其他 DNA 修复途径, 包括争端修复¹⁴。活化 PARP1 使用烟酰胺腺嘌呤核苷酸 (和⁺) 作为基板, 以 ADP-ribosylate 多靶蛋白, 包括本身。近年来, 这种酶和其他家族成员引起了人们的广泛关注, 因为 PARP 抑制剂已经成为一种有前途的癌症治疗药物。虽然 PARP 抑制剂最初被发现是有效的乳腺癌基因 (BRCA)-突变乳腺癌细胞, 现在有大量的证据, 他们的影响, 在单一和联合治疗与 DNA 损伤的代理人/辐照广泛的癌症的突变不限于 BRCA^{15,16,17,1819}。

在分子水平, PARP 活化被证明在组织地方染色质结构在损伤站点扮演重要角色。依赖于标准的染色质修饰酶的招募促进了争端修复, 并决定了修复路径的选择, 这表明了在损伤部位进行 par 修饰的重要脚手架作用。 ¹³ ,^21,22,,²⁴,^25,26,2728,^2930,31我们最近演示了将 p53-binding 蛋白 1 (53BP1) 从损坏点排除在 PAR ³²之外, 为非同源 endjoining 的53BP1 依赖 hyperactivation 提供了另一种解释 (NHEJ) 通过 PARP 抑制剂和突出 PARP 的意义在争端修复路径选择^33,34。PARP1 也直接 PARylates 并影响多种 DNA 修复因子的活性¹⁴。

使用激光 Microirradiation 作为一种工具来研究 DDR/修复在体内
在 1969年³⁵中首次描述了激光 microirradiation 在单个染色体上产生亚微米的变化, 并在1981年的³⁶中进行了详细的回顾。几十年后, 激光 microirradiation 被证明是诱导 dna 损伤在一个明确的微米区域的细胞核, 并被证明是一个有价值的技术, 研究招募或修改各种因素的 dna 损害在体内^{13,37,38,39,40,41}. 此方法允许检测未形成明显辐射诱发病灶 (IRIF) 在损伤部位的那些因素^39,42。也可以在损伤部位和细胞核的其余部分研究染色质结构变化的时空动力学。我们仔细比较了不同激光系统诱导的 ddr 和输入功率, 以评估 DNA 损伤类型与 microirradiation 条件之间的关系^{32,43,44, 45}。在先前的激光损伤研究中观察到了53BP1 和端重复约束因子 2 (TRF2) 的异常招聘模式, 这为激光损伤的 “非生理性” 特性的反复关注提供了依据^{46 ,47,48,49}。我们发现, 这些明显的差异现在可以解释的差异 PARP 信号, 测量的数量和复杂的诱导损害³²。我们证实: 1) 激光 microirradiated 细胞 (即使在高输入功率辐照后) 在界面中以损伤检查点控制的方式被逮捕, 并且保持可行 (至少 48 h)^32,50;和 2) 修复因子的招募/修改忠实地重述那些观察与常规 DNA 损伤药物和争端处理酶^{32,39,42, 44、50、51、52}。这些结果强烈支持研究激光损伤诱导的细胞反应的生理相关性。