Dissection de la rétine humaine et pre-choroïde pour l’analyse protéomique
Summary
La rétine humaine est composée de régions fonctionnellement et moléculairement distinctes, y compris la fovéa, la macula et la rétine périphérique. Nous décrivons ici une méthode à l’aide de biopsies punch et élimination manuelle des couches de tissu d’un œil humain de disséquer et recueillir ces régions rétiniennes distinctes pour l’analyse protéomique en aval.
Abstract
La rétine humaine se compose de la neuroretina sensorielle et le sous-jacent épithélium pigmentaire rétinien (RPE), qui est fermement complexé à la couche choroïde vasculaire. Différentes régions de la rétine sont anatomiquement et moléculairement distinctes, faciliter les fonctions uniques et montrant la différence de susceptibilité à la maladie. Analyse protéomique de chacune de ces régions et couches peut fournir des informations vitales dans le processus moléculaire de nombreuses maladies, notamment la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), diabète sucré et le glaucome. Toutefois, la séparation des régions rétiniennes et des couches est essentielle avant l’analyse protéomique quantitative peut être effectuée. Nous décrivons ici une méthode de dissection et collection des régions rétiniens fovéale, maculaires et périphériques et sous-jacent pre-choroïde complexe, impliquant des biopsies punch régional et élimination manuelle des couches de tissus de l’oeil humain. Unidimensionnel SDS-PAGE, mais aussi l’analyse protéomique en aval, comme la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS), peut servir à identifier les protéines dans chaque couche rétinienne disséqué, révélant des biomarqueurs moléculaires de la maladie de la rétine.
Introduction
La rétine, RPE et choroïde sont des tissus complexes qui démontrent des différences régionales importantes dans l’expression de la protéine, une fonction physiologique et pathologique de susceptibilités1,2. Par exemple, les maladies comme la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), rétinite pigmentaire et Rétinopathie séreuse centrale chaque démontrent localisation caractéristique dans la fovéa, macula ou rétine périphérie1,3, 4,6. Nous présentons ici une méthode démontrant comment distincte rétinienne régions peuvent être dégustées de façon indépendante. L’objectif général de cette méthode est de fournir un guide fiable pour la collecte des échantillons de tissu des centrale, maculaires et les zones périphériques de la rétine humaine et pre-choroïde pour l’analyse protéomique. La raison d’être pour le développement et l’utilisation de cette technique est que par le biais de l’analyse protéomique de ces régions rétiniennes spécifiques, importantes aperçus moléculaires peuvent être acquise dans les fonctions physiologiques et physiopathologiques de ces régions.
Cette approche promet de révéler le fondement de la protéomique de susceptibilités de maladie régionale relative et pour faciliter l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques. En effet, enquêtes de protéomique du corps vitré et ses interactions avec la rétine ont permis de mieux comprendre clés la composition moléculaire et la fonction des tissus sains et malades5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Toutefois, les analyses protéomique comparative claire des régions distinctes de rétiniens manquent. La technique vous aidera à soutenir ces études indispensables, offrant des avantages par rapport aux autres méthodes en présentant une collection tissus fiables et reproductibles. Plus encore, l’approche est très accessible, profitant du poinçon de taille standard et facilement accessibles des tissus outils de biopsie. Notre technique met l’accent sur la collection appropriée et le stockage des tissus pour la protéomique traitement, faire des considérations importantes pour la stabilité des protéines et de la dégradation. Ainsi, cette méthode est plus appropriée pour les enquêteurs, considérant en aval analyse moléculaire des facteurs de la protéomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Après le tissu manipulation des échantillons, de collecte et de traitement sont des considérations essentielles14. Conservation dans l’azote liquide est préférable à une fixation chimique, car ce dernier peut causer des dommages à la structure des protéines, qui puisse fausser l’analyse en aval. En outre, préservation de l’azote liquide est préférable aux méthodes qui n’impliquent pas la congélation des échantillons. Notamment, Ferrer et coll. ont montré des différ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VBM est soutenue par des subventions de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 et R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 et la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York, NY. MT et GV sont pris en charge par les NIH grant T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
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