Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência
Summary
Fundo autofluorescência de amostras biológicas muitas vezes complica a técnicas de imagem baseada em fluorescência, especialmente em tecidos postmitotic humanos envelhecidos. Este protocolo descreve como autofluorescência destas amostras pode ser efetivamente removida usando uma luz disponível comercialmente, emitindo luz de diodo fonte para photobleach a amostra antes da imunocoloração.
Abstract
Imunofluorescência é um método comum usado para visualizar os compartimentos subcelulares e determinar a localização de proteínas específicas dentro de uma amostra de tecido. Um grande obstáculo para a aquisição de imagens de alta qualidade imunofluorescência é endógena autofluorescência do tecido causada por pigmentos de envelhecimento como lipofuscina ou por processos de preparação de amostra comum tais como fixação de aldeído. Este protocolo descreve como fluorescência de fundo pode ser grandemente reduzida com fotobranqueamento usando fósforo branco luz emitindo matrizes de diodo (LED) antes do tratamento com sondas fluorescentes. A amplo espectro emissão de fósforo branco LEDs permitem clareamento de fluorophores em toda uma gama de picos de emissão. O aparelho de fotobranqueamento pode ser construído a partir de componentes prontos para uso, a um custo muito baixo e oferece uma alternativa acessível para quenchers químicas disponíveis comercialmente. Um fotobranqueamento pré-tratamento do tecido seguido de mancha da imunofluorescência convencional gera imagens livre de autofluorescência de fundo. Em comparação estabelecida quenchers químicas que reduziu a sonda, bem como plano de fundo sinaliza, fotobranqueamento tratamento não teve efeito na intensidade de fluorescência da sonda enquanto efetivamente reduziu fundo e lipofuscina fluorescência. Embora fotobranqueamento requer mais tempo para pré-tratamento, matrizes de LED de intensidade mais elevadas podem ser usados para reduzir o tempo de fotobranqueamento. Potencialmente, este método simples pode ser aplicado a uma variedade de tecidos, tecidos particularmente postmitotic que acumulam lipofuscina, tais como o cérebro e músculos cardíacos ou esqueléticos.
Introduction
Microscopia de fluorescência usando anticorpos, proteínas específicas de direcionamento é rotineiramente usada para visualizar as proteínas de interesse em cultura de células e tecidos. Uma grande complicação para a aquisição de imagens claras e definitivas em imunofluorescência é autofluorescência, que pode ser causada endogenamente em tecidos de mamíferos pela idade do pigmento lipofuscina e por proteínas como a elastina e colágeno1, 2. Outras fontes de autofluorescência podem ser introduzidos através de etapas de preparação de amostra como aldeído fixação3. Grânulos de lipofuscina, compostos principalmente de proteína oxidativamente modificada e resíduos de degradação de lipídios, acumulam-se nas células de vida longa, com aumento de idade2. Isto provoca dificuldades em imagens postmitotic tecidos como o cérebro e os músculos cardíacos ou esqueléticos, como o espectro de emissão de fluorescência de lipofuscina é amplo e variável, muitas vezes coincidindo com o comprimento de onda de emissão de fluorophores comum usado para rotulagem de4. Esses fatores tornam a imagem do tecido do cérebro humano de casos de doenças neurodegenerativas de início tardio, como degeneração lobar frontotemporal (FTLD) especialmente desafiador.
Para reduzir a autofluorescência, criámos uma técnica na qual podemos irradiar as secções de tecido slide-montado com uma luz branca, emitindo a matriz de diodo (LED) usando uma lâmpada de mesa domésticos5. Esta técnica simples fornece uma alternativa às técnicas que usam químicas quenchers como CuSO4 em acetato de amónio, ou comercialmente disponível extinguer corantes como Sudão negro B e preto de eriocromo T6. Também tem significativa economia de custo sobre multiespectral técnicas de fotobranqueamento lâmpada de LED e evita complicações e artefatos gerados a partir de métodos de remoção de autofluorescência digital como espectral un-mistura7,8. Fósforo branco LEDs têm um amplo espectro de emissão, a alta luminosidade e a fabricação de baixo custo, tornando-os ideais como um componente de prateleira para fotobranqueamento uma variedade de cromóforos5,9.
Neste protocolo, demonstramos a construção de um aparelho de fotobranqueamento usando componentes acessíveis e aplicar fotobranqueamento para um caso de tecido FTLD contendo inclusões tau-positivo (FTLD-T), usando um anticorpo específico para tau fosforilada. Vamos demonstrar o efeito de fotobranqueamento na imagem fluorescente etiquetado anticorpos empregando dois cromóforos comumente usados: Alexa 488 e Texas Red. O efeito de fotobranqueamento contra seções não tratadas ou aqueles tratados com um quencher químico comercial são quantificados e comparados. Este pré-tratamento fotobranqueamento pode ser incorporado em qualquer protocolo de coloração padrão de imunofluorescência para remover autofluorescência em uma amostra biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fotobranqueamento pré-tratamento dos tecidos descrito neste manuscrito permite a eliminação eficaz de autofluorescência usando componentes prontos para uso. O protocolo descreve a imagem latente de imunofluorescência de agregados de tau fosforilada no tecido do cérebro humano fixada em formol usando anticorpos secundarios conjugados a Alexa 488 e vermelho Texas, com DAPI como um corante de contraste nuclear. Para aplicar o método para outros tecidos, recomendamos realizar um tratamento prévio de fotobranqueamen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado no todo ou em parte pelo consórcio canadense de neurodegeneração e envelhecimento (CCNA), o Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR), a sociedade ALS de Canadá (Canada ALS) e a sociedade de Alzheimer do Canadá (ASC). Os autores gostaria de agradecer ao sultão Sheilane e Andrew Reid do cérebro marítima tecido banco para fornecer os tecidos cerebrais FTLD, Milan Gomes do programa visando espaço-Temporal e amplificação da radiação resposta (STTARR) e suas afiliadas financiamento de agências para tecido, incorporação e serviços e o avançado óptico microscopia Facility (AOMF) para fornecer instrumentos de microscopia de seccionamento. Kevin Hadley é agradeceu pela revisão crítica do manuscrito.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
Riferimenti
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