אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הנחיות ניסיוני שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו אכפת חיה מוסדיים שימוש הוועדה. C57BL/6 (H-2 b) הנקבה עכברים, 8 שבועות של גיל, נרכשו, עכברים – / – C57BL/6 AQP4 נמסרו על-ידי Verkman א. 1. חיסון של עכברים עם פפטידים AQP4 להכין פרוינד שלמה ' מלאי עבודה אדג’וונט (CFA) s. לטחון דק הכנה מיובש של מ. שחפת (H37Ra) באמצעות ומכתש. הוסף קרקע H37Ra כדי לא שלמה פרוינד ' s אדג’וונט כדי ריכוז סופי של 4 מ”ג/מ”ל. פרנק שניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. התמוססות lyophilized אנטיגן (Ag) פפטיד AQP4 בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי ריכוז סופי של 1 מ”ג/מ”ל. לשמור על 4 ° C או על קרח להכין ההרכבה של 2 מזרקים נעל-סכינים סטריליים, הצטרף עם צימוד, המכיל האמולסיה פרנק/פפטיד. צרף מזרק נעל זכוכית-זכוכית ללא הבוכנה צימוד ניילון 3-way עם 2 קשרים סכינים סטריליים זכר-lock. סגור את צימוד על ידי מיתוג את ידית לכיוון המזרק. מקם את הקצה הפתוח של המזרק למעלה, המאפשר את המזרק לפעול כמו מבחנה. שם את זה מתלה צינור ליציבות נוספת. מלאי עבודה מערבולת פרנק, הפתרון Ag. להוסיף נפח 1:1 של פפטיד / פרנק את המזרק פתוח. 200 µL של פרנק/Ag (4 x 50 µL) נדרש לכל העכבר. הערה: בדרך כלל, כ 1 מ”ל של הכנה הולך לאיבוד צימוד, אשר תפחית את כמות זמינה עבור חיסונים. לכן חשוב לשלב זה חישוב הנפח הכולל הנדרש. דוגמה: עבור חיסונים של עכברים 5: (חיות חיים µL x 5 200) + 1 מ”ל יותר נפח = 2 מ”ל סך פרנק/Ag דרוש. הכנס על הבוכנה זכוכית לתוך המזרק ובזמן המחזיקים אותו במקומו, להפוך את המזרק כך צימוד מכוון כלפי מעלה. לעבור את ידית צימוד החיבור הנשי שאינם בשימוש. בזהירות הפעילו לחץ על הבוכנה זכוכית כדי להסיר עודפי המזרק. הנוזל מילוי החיבור נעל-סכינים סטריליים הזכר השני של צימוד. לצרף מזרק זכוכית השני (הבוכנה הוכנסה במלואה) החיבור נעל-סכינים סטריליים הזכר השני של צימוד. . זה אמור להיות מערכת סגורה של מזרקים זכוכית 2 קשור של צימוד המכיל כ אוויר עודף קטן ככל האפשר. ליצירת תחליב, לערבב על ידי סתימות של לעבור הנוזל לסירוגין בין מזרקים 2 עבור 2 דק צ’יל תארגן את הדברים על קרח במשך כ 10 דקות חוזר את מצמררת ולערבב עד שלא יהיה שינוי ברור צמיגות התכשיר , וכתוצאה מכך ברוטב נוקשה מאוד, לבן. להכניס למקרר של מזרקים המכיל האמולסיה ב 4 ° C או לשמור על קרח להעביר כל האמולסיה מזרק זכוכית-lock כוס אחת, להסיר את המזרק כוס ריקה ולהחליף אותו עם מזרק זכוכית-lock 1 מ”ל להזרקה. למלא את המזרק חדש אמולסיה, הסר אותה ממנה צימוד ולצרף מחט (25G x 5/8)- " מים -מבחן " האמולסיה עקביות. לגרש טיפת האמולסיה לתוך קערה קטנה עם מים. האמולסיה לא אמורים להתפזר, המציין כי זה מתאים הזרקת. אם האמולסיה מפזר, זה לא מוכן להזרקה; העברת הנוזל בחזרה לתוך הכוס מזרקים וממשיכים לערבב, ואז מקררים שוב עד האמולסיה, זה השריר המתוח. מבחן האמולסיה שוב עד מרקם תקין השיגה. להזריק עכברים – / – תורם AQP4 subcutaneously (ש) עם תחליב המכיל את פפטיד AQP4. כל עכבר מקבל 4 x 50 µL ספורטינג זריקות (200 µL הכולל (פפטיד µg 100)). האתרים 4 לכלול הן את צידי הבטן התחתונה, אשר נשפכים בלוטות הלימפה במפשעה (בתוך), והן את שני הצדדים של הקיר החזה המדיאלי כדי כל בית השחי, אשר נשפכים LN. בבית השחי העברת המאמצת ידרוש 1-2 עכברים לחסן התורם לכל נמען העכבר. 2. תרבית תאים T ו- Proinflammatory T תא קיטוב 10-12 ימים לאחר חיסון, לאסוף LN העכברים. במגש קרח, להכין צלחות פטרי 60 מ מ מצוידים עם מסננת תא (רשת שינוי גודל 70 מיקרומטר), המכיל צוננת המדיה RPMI עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- U/mL 100 פניצילין-100 µg/mL סטרפטומיצין (עט-דלקת) (RFPS). Euthanize עכברים כתוצאה מחשיפה CO 2, ואחריו נקע בצוואר הרחם. לטבול עכברים ב-70% אתנול, ואז להצמיד לו כל טביעות רגל ללוח לנתיחה. חותכים חתך בעור קו האמצע מהמפשעה בצוואר ומטה בכל רגל. משוך את העור מן הצפק ולהדק אותו tautly ללוח. לנתח LN המפשעתית, בבית השחי, מניחים צלחת פטרי המכילות RFPS, על קרח. 19 לניסויים העברה המאמצת, לשלב בתוך של כל בעלי החיים בתוך הקבוצה חיסונים. עבור ניתוחים cytometric זרימה של שימוש Vβ, להפריד בעוד חיות בודדות. מניחים מסננת את התא המכיל את LN לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL המכיל RFPS. השתמש סוף פומפה מזרק 5 מ ל סטרילי שטוח להקיש בתוך התאים דרך מסננת, כביסה עם 20-30 מ של RFPS כדי לאפשר התאוששות של התאים. לשמור על תאים בתוך קרח במהלך העיבוד עד זמן תרבות. לשטוף פעמיים, צריך שתוציאו ב 393 x g למשך 5 דקות. לאחר השטיפה השנייה resuspend התאים LN בתקשורת תא T (TCM). TCM מכיל RPMI עם 10% חום-לא פעיל FBS, 292 µg/mL-גלוטמין, 110 פירובט נתרן µg/mL, ו- 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, עט-דלקת. בדרך כלל, משמש אמצעי אחסון של 5 מ ל TCM לכל תורם העכבר. לספור את התאים LN. התשואה הצפוי הוא כ 3-6 x 10 7 בתוך תאים לכל חיסון העכבר התורם. להפריש 3-4 x 10 6 עבור וזמינותו התפשטות (ראה סעיף 3 להלן). להגדיר מקטב תרבויות להעברת המאמצת (סעיף 6). להכין Th17 תרבות מהפכנית של 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL העכבר רקומביננטי אינטרלויקין (IL)-23 ועכבר רקומביננטי ng/mL 10 IL-6 ב TCM. לחילופין, עבור Th1 קיטוב, להכין תרבות של 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag ועכבר רקומביננטי ng/mL 10 IL-12 ב TCM. להוסיף 2 מ ל (1 x 10 7 תאים) לכל טוב של התערובת תרבות מהפכנית על פלטה 12-. טוב. התאים בתוך 2-4 התורם עכברים ימלא לוח 12-טוב אחד. לשמור על תרבויות חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור ה 72 בדיקה חזותית התאים LN בתרבות להפעלה ב 48 שעות ו ה 72 הופעל תאים יהוו אשכולות רב תאי T יגדל בגודלם, הופך להיות יותר pleomorphic. העלייה בחילוף החומרים יגרום פגיעה של ה-pH בתקשורת, החלפת מ אפרסק כתום. אם ה-pH נמוך מספיק כדי להפעיל את המדיה צהוב, להוסיף 1 מ”ל של TCM טריים כדי למנוע רעילות תאים ה 24 הנותרים המשך סעיף 6 להעברת המאמצת. קיטוב יעילות ניתן לבירור על ידי ציטוקינים תאיים מכתים (ICS), כמו לתארibed בסעיף 5. להגדיר תרבויות באמצעות LN של עכברים בודדים עבור ניתוח תזרים cytometric Vβ משטח הביטוי (סעיף 4). להכין 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag ב- TCM. להוסיף 2 מ ל (1 x 10 7 תאים) של התרבות לכל טוב על פלטה 12-. טוב. תרבויות צריכה להישמר ב חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 10 ימים. המשך סעיף 4- 3. התפשטות Assay הערה: זה ממשיך מ סעיף 2.4. להכין 3-4 מ”ל של תאים בתוך צינור, 2 x 10 6 תאים לכל מ ל TCM. לערבב בעדינות את התאים על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולאחר מכן להעביר שוקת סטרילי. שימוש pipettor רב-ערוצי כדי µL 100 צלחת של תאים לכל טוב לתוך סיבוב 96-ובכן הצלחת התחתונה תרביות רקמה. בדרך כלל, צלחת 15 בארות בדיקה triplicate של 4 Ag ריכוז והפניה אין Ag- לדלל את Ag ב TCM בריכוזים שונים, µg בדרך כלל 80, 20, 5, 1 ו- 0/mL (עבור מניות x 2). להוסיף 100 µL ריכוז כל דולר עבור ריכוז סופי של 40, 10, 2.5. 0.5, 0 µg/mL. תקופת דגירה של 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס. הערה: צעדים 3.5 דרך 3.7 כרוכה בחומרים רדיואקטיביים. שימוש נאות במשאבי, ניטור וסילוק של חומרים רדיואקטיביים יש לנהל, לפי תקנות ממשלתיות המוסדיות. להכין פתרון מלאי עבודה של 3 H-תימידין (40 µCi/mL) על ידי הוספת mCi 1 3 H-תימידין 25 מ ל RPMI, ולאחסן את זה ב-4 ° C. Pipet 0.5 מ”ל של הפתרון עובד לתוך שוקת סטרילי. להוסיף 25 µL של 3 H-תימידין (1 µCi) לכל שימוש טוב של pipet רב-ערוצי. תקופת דגירה של h 18 נוספים 37 מעלות צלזיוס. קציר תאים על גבי שטיחון מסנן זכוכית באמצעות קומביין תא 96-ובכן ולשטוף עם 70% אתנול. לאחר הייבוש, חותם על המזרן מסנן לתוך שקית פלסטיק מדגם עם נצנוץ מ ל נוזל. מדד רדיואקטיביות כל טוב באמצעות מונה נצנוץ. 4. Flow Cytometry ניתוח תא השטח TCR Vβ ביטוי הערה: זה ממשיך בסעיף 2.6. נוגדנים עבור העכבר TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 ו- 5.2, 6, 7, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 10 ב, 11, 12, 13, 14, ו 17a זמינים מסחרית לבדיקת הביטוי TCR Vβ. גילוי של TCR Vβ, לסלק תאים T מהצלחת תרבות על-ידי pipetting מספר פעמים ולהעביר תאים לרכבת התחתית. לשטוף עם FACS מאגר (פנסיון מלא) המכיל 2% FBS, אזיד הנתרן 0.1% ו- 2 מ מ EDTA ב- PBS. העברת תאים צלחת V-התחתון 96-ובכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 5 3 x 10 6 תאים לכל טוב. אם כל הלוח. Vβ נבחנת, התאים יופצו לתוך בארות מרובים (באר אחת לכל Vβ הנבדקת). הכללת תאים מתים מניתוח תזרים cytometric על ידי צביעת עם צבע הכדאיות חי/מת, אשר מגיב אמינים חינם שנחשפו על ידי תאים עם נמק. בצע את היצרן ' s הנחיות צנטריפוגה, resuspension, צבען הכדאיות. דגירה על קרח במשך 10-20 דקות ברחבי התא מכתים הליכים, להגן על תאים מפני אור ולשמור על קרח לאחר דגירה, לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB. כדי לזהות TCR Vβ, להשעות את התאים µL 100 של פנסיון מלא המכיל לדילול מטריים נוגדנים עבור CD4 (לשבט RM4-5) ו TCR Vβ. תקופת דגירה של 15-60 דקות על קרח לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB ולתקן את התאים על-ידי הוספת µL 200 של 4% paraformaldehyde מדולל ב- PBS. תקופת דגירה של 20 דקות על קרח. לשטוף את הצלחת ב FB ולנתח על ידי cytometry זרימה. 5. זרימה Cytometric ניתוח לייצור ציטוקין תאיים עבור ציטוקין תאיים מכתים (ICS), מתייחסים תרביות תאים T לדילול 1:1,000 חלבון התחבורה מעכב ריאגנט (למשל, GolgiPlug) ב- TCM, 4 שעות לפני ICS כדי למנוע הפרשת ציטוקינים. באותו הזמן, להפעיל את תאי T עם 50 ננוגרם למ”ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ו 500 ננוגרם למ”ל ionomycin וכדי לעודד ייצור החלבון. לאחר 4 שעות של תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, מכך התאים מהצלחת תרבות על-ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר שפופרת צנטרפוגה (15 או 50 מ”ל). כביסה עם פנסיון מלא. Resuspend התאים ב- FB והעברתן ל צלחת V-התחתון 96-ובכן-צפיפות של 5 x 10 5 3 x 10 6 תאים לכל טוב. הכתם תאים עם צבע הכדאיות כפי שתואר לעיל (סעיף 4.2). לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB. להוסיף נוגדנים לצורך זיהוי סמנים משטח כדלקמן: לצורך זיהוי סמני פני השטח, להשעות את התאים µL 100 של FB המכילה לדילול מטריים נוגדן CD4 (לשבט RM4-5). כוללים באופן אופציונלי, נוגדנים עבור B220 (כפיל 30-F11) ו CD11b (שיבוט M1/70)-לדילול בטחונות כדי לשפר את דרך השער של תאי B, ומונוציטים/מקרופאגים, בהתאמה. באופן כללי, PE-Cy7 anti-CD4, FITC אנטי-B220 ו- PerCP-Cy5.5 אנטי-CD11b עובד טוב. הבחירה של נוגדן/fluorochrome conjugates צריך להיות מונחה על ידי קביעת התצורה של זרימת cytometer כדי לשמש לניתוח, ריכוז אופטימלי של נוגדנים צריך להיות נחוש מדעית. תקופת דגירה של 15-60 דקות על קרח Resuspend תאי µL 200 של קיבעון/Permeabilization פתרון עבור 20 דקות על הקרח וקונטה לצלחת עם פנסיון מלא. זה לתקן את התאים, permeabilize את הממברנות. על מנת לשמור על permeabilization של קרום התא במהלך ההכתמה תאיים, השתמש פרם/שטיפת מאגר (PW) (מדולל 1:10 מן המלאי X 10) במקום פנסיון מלא. לשטוף את בארות µL 200 של PW. עבור ICS, להתכונן לדילול מטריים הנוגדנים אינטרפרון (IFN)-γ ו- IL-17A באמצעות 1 x PW. אפשרות אחת היא APC אנטי-IFN-γ (שיבוט XMG1.2) ו- PE אנטי-IL-17A (שיבוט eBio17B7) אשר עובד היטב. Resuspend תאים µL 100 של הנוגדן תאיים קוקטייל, ואז תקופת דגירה של פחות 15 דקות. זה גם אפשרי להמשיך ההכתמה בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס לשטוף את בארות µL 200 של PW resuspension ב FB עבור cytometry זרימה. במקביל, מכינים דוגמה וללא רבב (תאים ב- FB ללא נוגדנים) כדי למטב את המתחים גלאי ודוגמאות שהוכתמו יחיד עבור כל fluorochrome בודדים (קרי, תאים או פיצוי חרוזים צבעונית עם נוגדן אחד בלבד/fluorochrome) כדי לקבוע פיצוי והתאמת הערכים. באמצעות cytometer של זרימה, לרכוש ≥ 10,000 תאים (אירועים), gating על CD4 (חי/מת-שלילי) בת קיימא + תאים. כדי להבטיח gating מדויק של תאי T, לא לכלול את B220 +, CD11b + תאים (תאי B ו ומונוציטים/מקרופאגים, בהתאמה). בתוך CD4 + T תא subpopulation, לקבוע את אחוזי תאים IFN-γ (Th1 היוחסין) או איל-17A (Th17 היוחסין). 6. המאמצים תאים העברה של פתוגניים T ספציפי AQP4 הערה: שלב זה בעקבות סעיף 2.5: קיטוב תא T תרבות, proinflammatory תא T. תאים לשחזר מקוטב מבאר-12 צלחות על-ידי pipetting למעלה ולמטה מכך ולאחר העברת צינור 50 מ. אמאintain על הקרח עד זריקות. לספור את התאים, לשטוף פעמיים ב- PBS קר והכן השעיה של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ב- PBS. באופן כללי, מזריקים תאים בתוך השעה. בעדינות לערבב את התאים על ידי מתערבל ולהעביר מזרק 1 מ”ל בזמנו של הזרקה. ניהול µL 200 של התאים (2 x 10 7) דרך הווריד (עירוי) העכבר כל אחד, דרך הזנב הווריד. להזריק כל של העכבר הנמען i.p. עם 200 ng של שעלת דרב רעלן מעורבבת עם µL 200 ל- PBS באותו היום, יומיים לאחר מכן. לפקח על עכברים מדי יום עבור סימנים של מחלה. 7. הערכה קלינית של ATCA לבחון עכברים הנמען מדי יום עבור סימנים קליניים של CNS מחלת חיסון עצמי. באופן כללי, עכברים יראה סימנים של מחלת חיסון עצמי CNS 5-8 ימים לאחר העברה המאמצת של תאי T AQP4 ספציפיים. העכברים יציג סימפטומים קליניים של חוסר תפקוד נוירולוגי. זה עוזר לבצע ההערכות על עכבר תמים כדי להגדיר את היכולת הרגילה של עכבר. צליל עכברים הערך עבור אובדן של הזנב. החזק בעדינות את העכברים בבסיס הזנב והרם זקוף. זנב כי משתפלת ברציפות הוא לתאר אובדן של הזנב טון (ציון של 1). אובדן של הזנב הטון לעתים קרובות הסימן הראשון של המחלה הקלינית. רפלקס מבחן עבור ליישר על-ידי הנחת העכבר על גבו על משטח שטוח. איטי בטעותו הוא סימן של חוסר קואורדינציה truncal (ציון של 2). עכבר תמים לחלוטין לעמוד כל ניסיון למקם אותו על גבו, אז בשום איטיות ביכולת נכון הוא הבקיע כמו תפקוד לקוי. זה אופייני כדי לבדוק את העכבר 3 – 4 פעמים בשביל זה רפלקס. הערך יציבה, ambulation. עכברים מתחילים להראות שינוי בתנוחה וכתוצאה מכך פגיעה או גרירה של הירכיים במהלך ambulation (ציון של 2.5). עוד תוצאות המחלה monoplegia, שיתוק מוחלט של אחד הינד האיבר (ציון של 3.0), שיתוק גפיים, שיתוק מלא של שני הינד בגפיים (ציון של 3.5). Quadraparesis מתון, חולשה של כל ארבעת הגפיים, התוצאות בתנועה קדימה באיטיות (ציון של 4). Quadraparesis חמורה מאפשר כמעט אין תנועה קדימה (ציון של 4.5). לבסוף, עם מחלה קשה הם עשויים להפוך אדעך או למות (ציון של 5). מנהל לעכברים לאבד את היכולת לרכוש מזון נוזל או מוצק 1 מ”ל של 5% גלוקוז ב- saline i.p.. לחלופין, השתמש תוספי עם נוזל ג’ל כוסות, גבוהה הקלוריות ג’ל ובייקון רגשות כדי לנטרל התייבשות, מניעת מזון. המתת חסד עכברים אדעך. 8. היסטולוגיה והכנה רקמת עזים ומתנגד עכברים עם קטמין 100 מ”ג/ק”ג ו- 10 מ”ג/ק”ג חריגות השירותים הווטרינריים ולאחר מכן להצמיד לו כל טביעות רגל לקרש חיתוך. פתח את החזה, לחשוף את הלב. פצעים וחתכים הכבד להתיר תזרים דם. לצרף מחט פרפר הצנרת של משאבת מהירות משתנה miniflow באמצעות מאגר נפרד עבור פורמלין PBS ו 10%. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב, perfuse עם 5 מ של PBS, ואחריו 25 מיליליטר 10% פורמלין. להסיר את הראש ואז העיניים. הרשתית כפי שתואר לעיל 20 והעיניים תהליכים. חצו ארובות העיניים, להוסיף מספריים על האף, לחתוך את הגולגולת והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה בכל צד. אסיר את הגולגולת, לחשוף את העצבים האופטים, לחתוך הצנטר, הכנס קלטת בין 2 מזרוני הספוג הרגילים. Immerse ב 10% פורמלין (24 שעות), ואת ואז 50% אתנול (24 שעות) ואז העברת אתנול 70%- להסיר את המוח וחוט השדרה ומניחים בפורמלין 10%. באופן סדרתי סעיף המוח במישור הילתית; סעיף מה בתוך הווריד (בערך חצי) ואת טורי הפרונטליים מטוסים (כ 20 חתכים לכל עכבר). דגימות CNS תהליך שגרתי להטבעת פרפין. כתם 8 מיקרומטר מקטעים עבה עם hematoxylin ו אאוזין (העצבים האופטים) או Luxol מהיר כחול-hematoxylin אאוזין (המוח ועמוד השדרה). להעריך את העצבים האופטים לנוכחות של דלקת בתוך העצב, קרומי המוח שמסביב (לדלקת בעצה הראייה) או בעיקר בכל קרומי המוח שמסביב (perineuritis סיב אופטי). נחשב של קרום המוח, parenchymal מוקדים דלקתיים (> 10 תאים תאי באשכולות) הדגימות המוח וחוט השדרה עבור כל עכבר. 9. אין ויוו ברשתית הדמיה על ידי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) הערה: הדמיה ברשתית OCT בתחום ספקטרלי של עכברים מתבצע באמצעות ציוד מסחרי (למשל, Spectralis עם TruTrack עין המעקב) כדי להשיג את העינים עקבי התמצאות להפחית לכלוכים תנועה- חמש דקות לפני הדמיה, להתרחב תלמידים עם 1% tropicamide (טיפה אחת לכל עין) והניחו העכבר לדימות בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה, מתן זרימה קבועה של 2 ליטר מינימום (1.5% איזופלוריין). להפעיל את השטיח חום ולהכין בכלובי ההתאוששות שלאחר ההרדמה. במקום בעכבר על הגליל הדמיה ולנתב מחדש את הזרימה הרדמה בהתאם. להגן על העיניים עם methylcellulose hydroxypropyl 0.3% כדי לשמור על לחות העין, כדי להבטיח המשכיות שבירה. במקום עדשות מגע מותאם אישית על העין כדי להיבדק. מודרך על ידי לתמונה הפונדוס אינפרא-אדום, לכוון את הלייזר לעין, המבטיח הקרן ממורכזת על ראש עצב הראייה. סריקות OCT אופקיים ואנכיים עליך לוודא כי הרשתית מטילה בניצב כדי הלייזר. 25 לבצע סריקות B ברסטר מ-30 ומצב ברזולוציה גבוהה בממוצע סריקות A. לאחר הדמיה בשתי העיניים, להסיר את עדשות המגע ולהחיל אופטלמולוגיות ג’ל. להשאיר את העכבר לכלוב. שחזור חמים. 10. עיבוד וניתוח של OCT להשתמש את מודולרי הדמיה תוכנה עבור פילוח אוטומטיות. מקטעים ידנית הנכון המתאים הפנימיות הגבלת ממברנה (ILM), השכבה הפנימית plexiform (IPL), המייצג את הגבולות של הרשתית הפנימי שכבות (IRL) 21- ודא בשכבת סיבי עצב ברשתית (RNFL), השכבה תא גנגליון (שזכתה) שיקוב של IRL, לא יחפפו. בעוביים IRL לחשב באמצעות הרשת 2 בתחילת טיפול סוכרתי רטינופתיה המחקר (ETDRS) עם קטרים של 1, 2 ו- 3 מ מ ממורכז על דיסקים אופטיים, ו ייצוא לקובץ הגיליון האלקטרוני. התוכנה מחשבת עובי של כל אחת מהשכבות הרשתית על ידי חישוב ממוצע בכל מגזר רשת. לכן, קטע מרכזי, המקביל בראש עצב הראייה, הוא נשלל. ניתוח סטטיסטי הבדלים בין הקבוצות בכל נקודה בזמן. ניתוח בשתי העיניים עבור כל עכבר, באמצעות מוכללת הערכת משוואות עם מטריצת מתאם להחלפה והתאמות מתאמים בין העין אינטרה-הנושא 21-