Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met inachtneming van experimentele richtsnoeren goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco institutionele Animal Care en gebruik Comité. C57BL/6 (H-2 b) vrouwelijke muizen, 8 weken oud, werden aangekocht en C57BL/6 AQP4 – / – muizen werden verstrekt door A. Verkman. 1. immunisatie van muizen met AQP4 peptiden bereiden volledige Freund ' s adjuvans (CFA) werken voorraad. Fijn vermalen een gedroogde voorbereiding van M. tuberculosis (H37Ra) met behulp van een mortier en een stamper. Toevoegen gemalen H37Ra om onvolledige Freund ' s adjuvans aan een eindconcentratie van 4 mg/mL. CFA kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden. Los gelyofiliseerd antigeen (Ag) AQP4 peptide in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Bewaren bij 4 ° C of op ice. Voorbereiding van de vergadering van 2 luer-lock spuiten, samen met een afsluiter, met de CFA-/ peptide emulsie. Toevoegen een glas luer-lock spuit zonder plunjer naar een 3-weg nylon afsluiter met 2 mannelijke luer-lock-aansluitingen. Sluit de afsluiter door over te schakelen van de hendel naar de spuit. Plaats het open einde van de injectiespuit omhoog, waardoor de spuit om te fungeren als een reageerbuis. Plaats deze in een rek van de buis voor extra stabiliteit. Vortex de CFA werken voorraad en de Ag-oplossing. Toevoegen van een volume van 1:1 van peptide / CFA aan de open spuit. 200 µL van CFA/Ag (4 x 50 µL) is vereist per muis. Opmerking: Normaal gesproken ongeveer 1 mL voorbereiding gaat verloren in de afsluiter, die het beschikbare bedrag voor immunisatie verminderen zal. Daarom is het belangrijk om te nemen in de berekening van het totale volume vereist. Voorbeeld: voor immunisatie van 5 muizen: (200 µL/dier x 5 dieren) + 1 mL extra volume = 2 mL totale CFA/Ag vereist. Plaatst u de plunjer glas in de spuit terwijl het bedrijf dat in de plaats, de injectiespuit omkeren zodat de afsluiter is naar boven gericht. De afsluiter hendel naar de ongebruikte vrouwelijke verbinding in te schakelen Zorgvuldig druk uitoefenen op de zuiger van het glas om het verwijderen van overtollige lucht uit de spuit. De vloeistof vult de tweede mannelijke luer-lock-aansluiting van de afsluiter. Sluit een tweede glas spuit (plunjer volledig ingevoegd) aan de tweede mannelijke luer-lock-aansluiting van de afsluiter. Dit moet een gesloten systeem van 2 glazen spuiten in verband met een afsluiter met als weinig overtollige lucht mogelijk. Maken van een emulsie, Meng door duwen de plunjers geschiedde de vloeistof afwisselend tussen de 2 spuiten voor ongeveer 2 min. Chill de spuiten op ijs voor ongeveer 10 min. Herhaal het koelen en mengen totdat er een duidelijke verandering in de viscositeit van het preparaat is , wat resulteert in een zeer stijf, witte emulsie. Het spuiten met de emulsie bij 4 ° C koelen of te handhaven op ice. Al de emulsie overbrengen in een glas luer-lock spuit, de spuit leeg glas verwijderen en vervangen door een spuit van 1 mL luer-lock voor injectie. Vul de nieuwe spuit met emulsie, verwijderen uit de afsluiter en hechten een naald (25G x 5/8). " water-test " de emulsie voor consistentie. Uitzetting van een daling van de emulsie in een kleine schotel van water. De emulsie moet niet verspreiden, wat aangeeft dat het geschikt is voor injectie. Als de emulsie verspreidt, is het niet klaar voor de injectie; overdracht de vloeistof terug in het glas spuiten en blijven mengen en vervolgens chill opnieuw totdat de emulsie stijf is. Test de emulsie opnieuw tot de juiste consistentie heeft bereikt. Donor AQP4 – / – muizen subcutaan injecteren (SC) met emulsie met de AQP4 peptide. Elke muis ontvangt 4 x 50 µL s.c. injecties (200 µL totale (100 µg peptide)). De 4 sites bevatten beide kanten van de onderbuik, die afwateren in de inguïnale lymfeklieren (LN), en beide zijden van de mediale aan elke oksel, borst muur die afwateren in LN. axillaris De adoptieve overdracht vergt 1-2 geïmmuniseerde donor muizen per geadresseerde muis. 2. T celkweek en Proinflammatory T cel polarisatie 10-12 dagen na immunisatie, LN van de muizen verzamelen. In een bakje ijs bereiden 60 mm petrischaaltjes voorzien van een cel zeef (maaswijdte grootte 70 µm) en met gekoelde RPMI media met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 100 U/mL penicilline-100 µg/mL streptomycine (pen-strep) (RFPS). Euthanaseren muizen door blootstelling aan CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie. Onderdompelen van muizen in 70% ethanol en vervolgens pin elke struikrover aan een dissectie. Gesneden een middellijn huid incisie van de lies naar de hals en naar beneden elk been. Trek de huid uit de buurt van het buikvlies en pin het strak op het bord. Lies en axillaire LN ontleden en plaats in de petrischaal met Inkoopproces, op ijs. 19 voor adoptief overdracht experimenten, combineren LN van alle dieren die binnen dezelfde immunisatie groep. Voor stroom cytometrische analyses van Vβ gebruik, LN te scheiden van individuele dieren. Plaats de zeef van de cel met de LN op een 50 mL centrifugebuis met Inkoopproces. Gebruik het platte einde van een steriele 5 mL spuit zuiger om te drukken de LN-cellen door de zeef, wassen met 20-30 mL RFPS om terugwinning van de cellen te vergemakkelijken. LN cellen op ijs gedurende de verwerking tot tijd voor cultuur behouden. Wassen tweemaal, centrifugeren bij 393 x g gedurende 5 min. Na de tweede wash, resuspendeer de cellen LN in T cel media (TCM). TCM bevat RPMI met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 292 µg/mL L-glutamine, 110 µg Mo/mL natrium pyruvaat, en 55 µM 2-mercaptoethanol en pen-strep. Meestal wordt een volume van 5 mL TCM per donor muis gebruikt. LN cellen tellen. Verwachte opbrengst is ongeveer 3-6 x 10 7 LN cellen per geïmmuniseerde muis donor. 3-4 x 10 gereserveerd 6 voor een proliferatie assay (zie paragraaf 3 hieronder). Instellen polariserende culturen voor adoptief overdracht (afdeling 6). Bereiden een Th17 polariserende cultuur van 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL recombinante muis Interleukine (IL) -23 en 10 ng/mL recombinant muis IL-6 in TCM. Als alternatief voor Th1 polarisatie, bereiden een cultuur van 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag en 10 ng/mL recombinant muis IL-12 in TCM. , Voeg 2 mL (1 x 10 7 cellen) per putje van de polariserende cultuur mengsel in een 12-well-plaat. De LN-cellen van 2-4 donor muizen vult een 12-well plaat. Handhaven van culturen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor 72 h. Visueel controleren de LN-cellen in cultuur voor activering op 48 uur en 72 h. actieve cellen zullen uitgebreide clusters vormen en de T-cellen zal toenemen in grootte, steeds meer pleomorfe. De toename van de stofwisseling zal leiden tot een verlaging van de pH in de media, wijzigen van perzik tot oranje. Als de pH laag genoeg is om de media te geel, voeg 1 mL verse TCM om te voorkomen dat toxiciteit voor de cellen in de resterende 24 h. Ga verder naar de sectie 6 voor de overdracht van de adoptie. Polarisatie-efficiëntie kan worden geverifieerd door intracellulaire cytokine kleuring (ICS), descrIBED in sectie 5. Opzetten van culturen met LN uit individuele muizen voor flow cytometrische analyse van oppervlakte Vβ meningsuiting (afdeling 4). Bereiden 5 x 10 6 LN cellen per mL met 10 µg/mL Ag in TCM. , Voeg 2 mL (1 x 10 7 cellen) van de cultuur per putje in een 12-well-plaat. Culturen moeten worden gehandhaafd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor 10 dagen. Gaat u verder met sectie 4. 3. Proliferatie Assay Opmerking: dit gaat verder vanaf punt 2.4. Bereiden van LN cellen in een buis, op 2 x 10 mL 3-4-6 cellen per mL in TCM. Voorzichtig mengen de cellen door het omkeren van de buis meerdere keren, en vervolgens overbrengen naar een steriele trog. Gebruik een meerkanaals pipet te plaat 100 µL per putje cellen naar een 96-Wells-ronde bodemplaat weefselkweek. Typisch, plaat 15 putten voor drievoudige testen van 4 Ag concentraties en een geen verwijzing van de Ag. Verdun de Ag in TCM in diverse concentraties, meestal 80, 20, 5, 1 en 0 µg Mo/mL (voor 2 x voorraden). Voeg 100 µL voor elke concentratie in drievoud voor een eindconcentratie van 40 10, 2.5. 0,5 en 0 µg Mo/mL. Incubeer gedurende ongeveer 72 uur bij 37 ° C. Opmerking: stappen 3.5 via 3.7 betrekken radioactieve materialen. Correct gebruik, monitoring en verwijdering van radioactieve stoffen moeten worden uitgevoerd, institutionele en gouvernementele reglementeringen. Bereiden een werken-stockoplossing van 3 H-thymidine (40 µCi/mL) door toevoegen van 1 mCi 3 H-thymidine aan 25 mL RPMI, en dit te bewaren bij 4 ° C. Pipetteer 0,5 mL van de werkoplossing in een steriele trog. Voeg toe 25 µL van 3 H-thymidine (1 µCi) per goed met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer gedurende een extra 18 uur bij 37 ° C. Oogsten van cellen op een glas filter mat met behulp van een 96-Wells cel harvester en spoel met 70% ethanol. Na het drogen, zegel het filter mat in een kunststof bemonsteringszak met 5 mL Scintillatie vloeistof. Maatregel radioactiviteit in elk goed met een teller scintillatie. 4. Stroom Cytometry analyse voor cel oppervlak TCR Vβ expressie Opmerking: dit gaat verder vanaf punt 2.6. Antilichamen voor muis TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 en 5.2, 6, 7, 8.1 en 8.2, 8.3, 9, 10, 11, 12, 13, 14 en 17 bis zijn beschikbaar commercieel voor het testen van de expressie van de TCR Vβ. Voor de detectie van TCR Vβ, T-cellen van de cultuur-plaat te verjagen door meerdere malen pipetteren en cellen overbrengen in een buis. Wassen met FACS buffer (FB) met 2% FBS, 0,1% natriumazide en 2 mM EDTA in PBS. Overdracht cellen naar een V-bodem 96-wells-plaat duikt met een dichtheid van 1 x 10, 5, 3 x 10 6 cellen per putje. Als de gehele Vβ paneel wordt getest, de cellen moeten worden verdeeld in meerdere wells (één putje per Vβ wordt getest). Uitsluiten dode cellen flow cytometrische analyse door kleuring met een LIVE/DEAD levensvatbaarheid kleurstof, die met gratis amines blootgesteld door necrotische cellen reageert. Volg de fabrikant ' s instructies voor centrifugeren en hersuspensie in levensvatbaarheid kleurstof. Incubeer op ijs voor 10-20 min. in de cel kleuring van procedures, cellen beschermen tegen licht en houden op ice. Na incubatie, wassen van de plaat eenmaal in FB. U wilt opsporen TCR Vβ, schorten de cellen in 100 µL van FB met een verdunning van de 1:100 van antilichamen voor CD4 (kloon RM4-5) en TCR Vβ. Incubeer gedurende 15 tot 60 min op ice. Wassen van de plaat eenmaal in FB en monteren van de cellen door het toevoegen van 200 µL van 4% paraformaldehyde verdund in PBS. Incubeer gedurende 20 min op ijs. Wassen van de plaat in FB en analyseren door stroom cytometry. 5. Stromen van de cytometrische analyse voor intracellulaire Cytokine productie voor intracellulaire cytokine kleuring (ICS), behandelen T celculturen met een verdunning van de 1:1,000 van eiwitreagens vervoer remmer (bijvoorbeeld GolgiPlug) in TCM, 4 uur voorafgaand aan ICS om te voorkomen dat cytokine secretie. Op dat moment, T-cellen met 50 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 500 ng/mL ionomycin te activeren om te induceren eiwitproductie. Na 4 uur van cultuur bij 37 ° C, cellen van de cultuur-plaat te verjagen door pipetteren op en neer, en overbrengen in een centrifugebuis (15 of 50 mL). Wassen met FB. Resuspendeer de cellen in de FB en transfer naar een V-bodem 96-wells-plaat duikt met een dichtheid van 5 x 10, 5 tot en met 3 x 10 6 cellen per putje. Vlek cellen met levensvatbaarheid kleurstof zoals hierboven (punt 4.2) beschreven. Na de incubatie, wassen van de plaat eenmaal in FB. Antilichamen voor detecteren van merkers van de oppervlakte als volgt toevoegen: voor de detectie van oppervlakte markers, schorten de cellen in 100 µL van FB met een verdunning van de 1:100 van antilichaam voor CD4 (kloon RM4-5). Desgewenst ook antilichamen voor B220 (kloon 30-F11) en CD11b (kloon M1/70) bij een verdunning 1:100 ter verbetering van gating van B-cellen en monocyten/macrofagen, respectievelijk. In het algemeen, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 en PerCP-Cy5.5 anti-CD11b werken goed. Keuze van geconjugeerde antilichaam/fluorescerende moet laten leiden door configuratie van stroom cytometer moet worden gebruikt voor analyse, en optimale concentraties van antilichamen moeten worden bepaald empirisch. Incubeer gedurende 15 tot 60 min op ice. Wassen van de plaat met FB en resuspendeer de cellen in 200 µL van fixatie/Permeabilization oplossing voor 20 min op ijs. Dit zal vast de cellen en permeabilize van de membranen. Teneinde de permeabilization van de celmembranen tijdens de intracellulaire kleuring, gebruik Perm/afwas buffer (PW) (verdunde 1:10 van de 10 X voorraad) in plaats van FB. Was de putjes in 200 µL van PW. Voor ICS, maak een 1:100 verdunning van de antilichamen voor interferon (IFN)-γ en IL-17A met behulp van 1 x PW. É㠩 n optie is APC anti-IFN-γ (kloon XMG1.2) en PE anti-IL-17A (kloon eBio17B7) die goed werkt. Resuspendeer de cellen in 100 µL van het intracellulaire antilichaam cocktail en vervolgens Incubeer gedurende minstens 15 min. Het is ook mogelijk te blijven de kleuring ‘s nachts bij 4 ° C. Wassen van de putten in 200 µL van PW en hersuspensie in FB voor stroom cytometry. Parallel, bereiden een onbevlekt monster (cellen in FB zonder antilichamen) detector spanningen en één gebeitste monsters voor elke individuele fluorescerende (dat wil zeggen, cellen of compensatie kralen gekleurd met slechts één antilichaam/fluorescerende) te optimaliseren compensatie spill-over waarden bepalen. Met behulp van een stroom cytometer, verwerven ≥ 10.000 cellen (gebeurtenissen), gating op levensvatbare (LIVE/DEAD-negatief) CD4 + cellen. Om ervoor te zorgen nauwkeurige gating van T-cellen, het uitsluiten van de B220 + en CD11b + cellen (B-cellen en monocyten/macrofagen, respectievelijk). Binnen de CD4 + T-cel populaties, bepalen van het percentage cellen uiting van IFN-γ (Th1 bloedlijn) of IL-17A (Th17 bloedlijn). 6. Adoptief Transfer van pathogene AQP4-specifieke T-cellen Opmerking: deze stap volgt uit punt 2.5: T cel cultuur en proinflammatoire T cel polarisatie. Recover gepolariseerde cellen uit 12-Wells-platen door pipetteren omhoog en omlaag om te verjagen, en over te dragen naar een tube van 50 mL. Maintain op ijs tot injecties. Cellen tellen, wassen tweemaal in koude PBS en maak een suspensie van 1 x 10 8 cellen/mL in PBS. In het algemeen, injecteren cellen binnen het uur. Zachtjes Meng de cellen door zwenken en overbrengen naar een 1 mL spuit ten tijde van de injectie. Beheren van 200 µL van de cellen (2 x 10 7) intraveneus (i.v.) aan elke muis, via de staart vein. Injecteer elke ontvangende muis i.p. met 200 ng van B. pertussis toxine verdund in 200 µL van PBS die dag en 2 dagen later. Controleren van muizen dagelijks voor klinische ziektesymptomen. 7. Klinische evaluatie van ATCA onderzocht ontvangende muizen dagelijks voor klinische symptomen van CNS autoimmuniteit. In het algemeen zullen muizen vertonen tekenen van CNS autoimmuniteit 5-8 dagen na adoptie overdracht van AQP4-specifieke T-cellen. De muizen zal klinische symptomen vertonen van een neurologisch dysfunctie. Het is nuttig voor het uitvoeren van de evaluaties op de muis van een naïef om te definiëren van het normale vermogen van een muis. Evalueren muizen voor het verlies van de staart Toon. Houd de muizen zachtjes aan de voet van de staart en heffen rechtop. Een staart dat neerhangt voortdurend wordt omschreven als het verlies van de staart tone (score van 1). Verlies van de staart Toon is vaak het eerste teken van klinische ziekte. Test voor vergissingen reflex door het plaatsen van de muis op zijn rug op een vlakke ondergrond. Langzame wetswijziging is een teken van truncal incoördinatie (score van 2). Een naïeve muis zal volledig weerstaan elke poging om het op zijn rug, zodat elke traagheid in het vermogen naar rechts is scoorde als een dysfunctie. Het is typisch voor de muis 3 – 4 keer voor deze reflex testen. Evalueren houding en ambulation. Muizen beginnen te tonen van een verandering in houding wat resulteert in een verlaging of het slepen van de heupen tijdens ambulation (score van 2,5). Verdere ziekte resultaten in monoplegia, volledige verlamming van één hind ledematen (score van 3.0) en dwarslaesie, volledige verlamming van beide hind ledematen (score van 3.5). Matige quadraparesis, zwakte van alle vier ledematen, resulteert in erg traag voorwaartse beweging (score 4). Ernstige quadraparesis kan bijna geen voorwaartse beweging (score van 4.5). Ten slotte, met ernstige ziekte kunnen ze ten dode opgeschreven worden of sterven (score van 5). Beheren met muizen die verliest het vermogen om te verwerven van vloeistof of vast voedsel 1 mL 5% glucose in zoute i.p. anderzijds gebruik suppletie met vloeistof gel bekers, hoge calorische gel en spek softies tegen uitdroging en voedsel ontbering. Stervende muizen euthanaseren. 8. Weefsel voorbereiding en histologie verdoving muizen met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, en vervolgens pin elke struikrover aan een dissectie. Open op de borst, het hart bloot. Incise van de lever om toe te staan van de uitstroom van het bloed. Een vlinder naald aan de buizen van een miniflow met variabele snelheid pomp met behulp van een apart reservoir voor PBS en 10% formaline koppelen. Steek de naald in het linkerventrikel van het hart en perfuse met 5 mL PBS, gevolgd door 25 mL 10% formaline. Het hoofd en dan de ogen verwijderen. Proces ogen en netvlies zoals eerder beschreven 20. Dwars door de oogkassen, invoegen van schaar op de neus en de schedel anterior to posterior gesneden aan weerskanten. Verwijderen van de schedel, de optische zenuwen bloot, snijd de optic opticum en plaats in een cassette tussen 2 schuim pads. Immerse in 10% formaline (24u), en vervolgens 50% ethanol (24u) en vervolgens transfer naar 70% ethanol. Verwijderen van hersenen en wervelkolom en plaatsen in 10% formaline. Serieel sectie hersenen in de coronale vlak; sectie spinal koorden in Sagittaal (ongeveer de helft) en seriële coronale vliegtuigen (ongeveer 20 dwarsdoorsneden per muis). Proces CNS monsters routinematig voor het insluiten van paraffine. Vlekken van 8 µm dik secties met haematoxyline en eosine (optische zenuwen) of Luxol snel blauw-haematoxyline en eosine (hersenen en ruggenmerg). Evalueren optische zenuwen voor de aanwezigheid van ontsteking in de zenuwen en de omliggende hersenvliezen (neuritis optica) of voornamelijk in de omliggende hersenvliezen (optische perineuritis). Meningeal en parenchymal inflammatoire foci tellen (> 10 geclusterde mononucleaire cellen) in de hersenen en het ruggenmerg monsters voor elke muis. 9. In Vivo Netvlies Imaging door optische coherentie tomografie (OCT) Opmerking: spectrale domein OCT retinale beeldvorming van muizen wordt uitgevoerd met behulp van commerciële apparatuur (bijvoorbeeld Spectralis met TruTrack eye tracker) om consistent oculair Oriëntatie en verminderen motion artefacten. Vijf min vóór imaging, verwijden van leerlingen met 1% tropicamide (1 druppel per oog) en plaats van de muis om het image worden gemaakt in de anesthesie inductie zaal, verstrekken van een gestage stroom van 2 liter per min (1,5% Isofluraan). Inschakelen van warmte mat en voorbereiden van de kooi na verdoving herstel. Plaatst u de muisaanwijzer op de imaging cilinder en de verdoving stroom dienovereenkomstig te leiden. Bescherm de ogen met 0,3% hydroxypropyl methylcellulose het oog om vochtig te houden en om de continuïteit van de breking. Plaats van een aangepaste contactlens op het oog om te worden onderzocht. Tochten door het beeld van de infra-rood fundus, direct de laser in het oog, ervoor te zorgen de lichtbundel is gecentreerd op de kop van de oogzenuw. Verticale en horizontale OCT scans moeten bevestigen dat het netvlies loodrecht aan de laser legt. Uitvoeren 25 B-scans in hoge resolutie modus en rasteren 30 € gemiddeld A-Scans. Na imaging beide ogen, verwijderen van contactlenzen en toepassen van oogheelkundige gel. Laat de muis in de kooi warme herstel. 10. Verwerking en analyse van LGO gebruiken de modular denkbaar software voor geautomatiseerde segmentatie. Handmatig juiste segmenten die overeenkomt met de binnenste membraan (ILM) en Meervormige binnenlaag (IPL) te beperken, die de grenzen van de innerlijke retinal lagen (IRL) 21. Verifiëren dat de retinale zenuw vezel laag (RNFL) en de ganglion cellaag (GCL) binnen de grenzen van de IRL wonen en elkaar niet overlappen. Berekenen IRL diktes met het vroege behandeling diabetische retinopathie studie (ETDRS) 2 raster met een diameter van 1, 2 en 3 mm gecentreerd op de optische schijf, en de uitvoer in een spreadsheet-bestand. De software berekent de dikte van elk netvlies laag gemiddelde van elke sector van het raster. Dus het midden segment, overeenkomt met het hoofd van de oogzenuw, is uitgesloten. Analyseren statistische verschillen tussen de groepen op elk tijdstip. Analyseren van beide ogen voor elke muis, met behulp van generalized schatten van vergelijkingen met een verwisselbare correlatiematrix en aanpassingen voor intra onderworpen Inter oog correlaties 21.