마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

모든 동물 절차는 캘리포니아 대학, 샌 프란 시스 코 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 실험 지침에 따라 수행 했다. C57BL/6 (H-2 b) 여성 쥐, 나이, 8 주 구입 했다 고 C57BL/6 AQP4 /- 생쥐 A. Verkman에 의해 제공 되었다. 1. AQP4 펩 티 드와 마우스의 면역 준비 완료 Freund ' s 보조 (CFA) 작업 사진. 잘게 갈아 M. 결핵 (H37Ra)는 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여의 desiccated 준비. 추가 지상 불완전 한 Freund에 H37Ra ' 4 mg/mL의 최종 농도에 s 보조. CFA는 4 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다. 디졸브 동결 건조 된 항 원 (Ag) AQP4 펩 티 드 1 mg/mL의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에. 또는 얼음에 4 ° C에서 유지 CFA/펩타이드 에멀젼을 포함 하는 자 지와 합류 2 luer 잠금 주사기 조립 준비. 연결 유리 luer 잠금 주사기 플런저 3 방향 나일론 자 지 2 남성 luer 잠금 연결을 하지 않고 . 주사기로 레버를 전환 하 여는 자 지를 닫습니다. 수 있도록 테스트 튜브로 주사기 주사기의 오픈 엔드 위치. 추가 안정성을 위한 튜브 랙에 배치. 소용돌이 CFA 일 재고 고 Ag 솔루션. 펩 티 드의 1:1 볼륨 추가 / 오픈 주사기에 CFA. CFA/Ag (50 µ L x 4)의 200 µ L가 마우스 당 필요. 참고: 일반적으로, 준비의 약 1 mL 접종에 사용할 수 있는 금액을 줄일 것입니다 자 지에 손실 됩니다. 따라서, 그것은 필요한 총 볼륨의 계산에이 통합 하는 것이 중요. 예: 5 마우스의 면역에 대 한: (200 µ L/동물 x 5 동물) + 1 mL 여분의 볼륨 = 총 CFA/Ag 필요한 2 mL. 는 주사기에 유리 플런저를 삽입 하 장소에서 그것을 잡고, 주사기를 반전 하는 자 지는 위로. 사용 하지 않는 여성 연결을 자 지 레버를 전환 합니다. 신중 하 게 주사기에서 초과 공기를 제거 하기 위해 유리 플런저에 압력을 적용 됩니다. 액체는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결 채웁니다. 는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결을 두 번째 유리 주사기 (플런저 완전히 삽입)을 연결 합니다. 이 가능한 작은 초과 공기 포함 하는 자 지와 2 유리 주사기의 닫힌된 시스템 이어야 한다. 에멀젼, 만들을 통과 하는 액체 또는 약 2 분 약 10 분에 대 한 얼음에 주사기를 반복 하는 냉 기에 대 한 2 주사기 사이 재미 plungers를 추진 하 고 준비의 점도 분명 변화 될 때까지 혼합 하 여 혼합 아주 뻣 뻣 한, 화이트 에멀젼의 결과로. 4 ° C에서 유제를 포함 하는 주사기를 냉장 보관 또는 얼음에 유지 한 유리 luer 잠금 주사기 유제의 모든 전송, 빈 유리 주사기를 제거 하 고 1 mL luer 잠금 주사기 주입을 위해. 유제와 새로운 주사기를 채우기는 자 지에서 제거 하 고 연결 바늘 (25G x 5/8). " 물-테스트 " 일관성 에멀젼. 물을 작은 그릇에는 유화 액의 한 방울을 추방. 유제, 주입을 위해 적합 하다는 것을 나타내는 분산 하지 해야 합니다. 유제 분 광, 경우 그것은 주입에 대 한 준비, 전송 액체 유리에 다시 주사기와 혼합 하 고 유제는 뻣 뻣 한 때까지 다음 다시 진정 계속. 적절 한 일관성을 달성 때까지 유제를 다시 테스트. 기증자 AQP4 /- 생쥐를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) AQP4 펩 티 드를 포함 하는 유제와. 각 마우스 4 x 50 µ L 사우스 캐롤라이나 주사 (200 µ L 총 (100 µ g 펩타이드))를 받습니다. 4 사이트 (LN) 사 타 구니 림프절으로 배수 하는, 더 낮은 복 부의 측 및 액 ln.로 배수 중간 각 겨드랑이 가슴 벽의 양쪽 모두를 포함 입양 전송 받는 사람 마우스 당 1-2 면역된 기증자 마우스 필요 합니다. 2. T 세포 배양 및 Proinflammatory T 세포 분극 예방 접종, 10-12 일 쥐에서 LN 수집. 아이스 트레이 준비 60mm 접시 셀 스 트레이너 (메쉬 크기 70 µ m)를 장착 하 고 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 냉장된 RPMI 미디어 및 100 U/mL 페니실린-100 µ g/mL 스 (펜-strep) (RFP) 포함. CO 2, 자 궁 경관 탈 구 다음에 노출에 의해 Euthanize 쥐. 70% 에탄올에 쥐를 담가 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀. 잘라 중간 피부 절 개는 사 타 구니에서 목에 각 다리. 복 막 떨어져 피부를 당겨 하 고 엄격 하 게 보드에 그것을 핀. 사 타 구니와 겨드랑이 LN을 해 부하 고 얼음에 RFP를 포함 하는 배양 접시 합니다. 19 입양 전송 실험, 같은 예방 접종 그룹 내에서 모든 동물에서 LN을 결합. Vβ 사용의 흐름 cytometric 분석, 개별 동물에서 LN 분리. RFP 포함 50 mL 원심 분리기 튜브에 LN을 포함 하는 셀 여과기를 놓습니다. 살 균 5 mL 주사기 플런저의 평면 끝을 사용 하 여 셀의 회복을 촉진 하는 RFP의 20-30 mL로 세척 여과기를 통해 LN 셀을 누릅니다. 문화에 대 한 때까지 처리를 통해 얼음에 LN 셀 유지. 세척은 두 번, centrifuging 393 x g 5 분 동안에. 두 번째 세척 후 T 세포 미디어 (TCM)에 선 셀 resuspend. 한 의학 포함 된 RPMI FBS, 292 µ g/mL L-글루타민, 110 µ g/mL 나트륨 pyruvate 그리고 55 μ M 2-mercaptoethanol 및 펜 strep 10% 열 비활성화. 일반적으로, 기증자 마우스 당 5 mL TCM의 볼륨 사용 됩니다. LN 셀을 계산합니다. 예상된 수확량은 약 3-6 10 7 선 세포 면역된 한 마우스 기증자 당 x. 3-4 x 10 마련해 6 확산 분석 결과 (아래 섹션 3 참조). 입양 전송 (6) 문화 편광 설정. 준비 5 x 10의 Th17 편광 문화 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL 재조합 마우스 인터 루 킨 (IL)-23와 함께 mL 당 6 LN 셀과 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 일리노이-6. 또는 Th1 분극에 대 한 준비 5 x 10의 문화 10 µ g/mL Ag와 mL 당 6 LN 셀 및 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 IL-12. 12-잘 접시에 편광 문화 혼합의 당 2 mL (1 x 10 7 셀)을 추가합니다. 2-4 기증자 쥐에서 LN 셀 한 12-잘 접시를 채울 것입니다. 72 헤에 대 한 5% CO 2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 문화 유지 시각적으로 확인 48 h에 활성화를 위한 문화에 선 셀와 72 h. 활성 셀 광범위 한 클러스터를 형성할 것 이다 T 세포 크기, 더 pleomorphic 되 고 증가할 것 이다. 신진 대사 증가 오렌지에 복숭아에서 변경 미디어에서 pH의 저하 될 수 있습니다. PH는 미디어 노란색을 충분히 낮은 경우 추가 1 mL의 나머지 24 h. 셀에 독성을 방지 하기 위해 신선한 TCM 섹션 6 진행 입양 전송 편광 효율 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine descr로 확인할 수 있습니다.섹션 5에서 ibed. 문화 흐름 표면 Vβ 식 (제 4)의 cytometric 분석에 대 한 개별 마우스에서 LN을 사용 하 여 설정. 준비 5 x 10 6 10 µ g/mL 중에 Ag와 mL 당 LN 셀. 12-잘 접시에 잘 당 문화의 2 mL (1 x 10 7 셀)을 추가합니다. 문화는 10 일 동안 5% CO 2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 유지 되어야 합니다. 제 4 이동. 3. 확산 분석 결과 참고: 2.4 절에서에서 계속이. 준비 3-4 mL 튜브, 2 x 10에 선 셀의 TCM에 mL 당 6 셀. 부드럽게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 세포를 혼합 하 고 살 균 구 유에 다음 전송. 96 잘 라운드로 사용 잘 당 세포의 플레이트 100 µ L 멀티 채널 pipettor 하단 조직 배양 플레이트. 일반적으로, 4 Ag 농도 및 아무 Ag 참조 triplicate 테스트용 15 우물 판. 다양 한 농도에서 TCM, 일반적으로 80, 20, 5, 1, 0 µ g/mL (2 x 주식)에 대 한 Ag 희석. 40, 10, 2.5의 최종 농도 대 한 3 중에 각 농도의 100 µ L를 추가 합니다. 0.5와 0 µ g/mL 약 72 h 37 품 어 ° c. 참고: 단계 3.5 3.7 통해 방사성 물질을 포함. 적절 한 사용, 모니터링 및 방사성 물질의 폐기 지휘 되어야 한다, 기관 및 정부 규정. 3 H 티 미 딘 일 재고 솔루션을 준비 (40 µCi/mL)으로 25 ml RPMI, 1 mCi 3 H 티 미 딘을 추가 하 고 저장이 4 ° C. 피펫으로 멸 균 여 물통으로 작업 솔루션의 0.5 mL. 추가 25 µ L 3 H 티 미 딘 (1 µCi) 잘 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 당. 추가 18 h 37에 대 한 품 어 ° c. 96 잘 셀 수확기를 사용 하 여 유리 필터 매트에 세포를 수확 하 고 70% 에탄올으로 씻어. 건조 후, 필터 매트 5 mL 섬광 액체와 플라스틱 샘플 봉지에 밀봉. 잘 사용 하 여 각 섬광 카운터에서 측정 방사능. 4. 세포 표면 TCR Vβ 식 Cytometry 분석 흐름 참고:이 섹션 2.6에서 계속 됩니다. 항 체 마우스 TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 및 5.2, 6, 7, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14, 그리고 17a TCR Vβ 식 테스트를 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다. TCR Vβ의 검색, 여러 번 pipetting으로 문화 판에서 T 세포를 꺼내 려 하 고 튜브 셀 전송. FACS 버퍼 (FB) 2 S, 0.1% 나트륨 아 지 드, 2 mM EDTA PBS에 들어와 씻고. 1 x 10 5 3 x 10의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 전송 셀 잘 당 6 셀. 경우 전체 Vβ 패널 테스트 되 고, 셀 여러 우물 (한 잘 테스트 되 고 Vβ 당)에 배포 해야 합니다. 회 저 성 세포에 의해 노출 되는 무료 아민과 반응 하는 라이브/죽은 생존 염료로 착 색 하 여 흐름 cytometric 분석에서 죽은 세포를 제외 합니다. 제조 업체에 따라 ' 원심 분리 및 생존 염색 물의 resuspension s 지시. 절차를 착 색 하는 셀에 걸쳐 10-20 분에 대 한 얼음에 품 어, 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 얼음에 계속 후 부 화, 세척 접시 한번 FB에. TCR Vβ를 검출 하기 위하여 중단 CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 FB의 100 µ L에 셀 (RM4-5 복제)와 TCR Vβ. 얼음에 15-60 분 동안 품 어 FB에 접시를 한 번 세척 하 고 4% paraformaldehyde PBS에 희석의 200 µ L을 추가 하 여 셀을 해결. 얼음에 20 분 동안 품 어. FB에 접시를 세척 하 고 cytometry 분석. 5. 세포내 Cytokine 생산에 대 한 Cytometric 분석 흐름 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 대 한 치료 단백질 수송 억제제 시 약 (예, GolgiPlug)의 1:1,000 희석와 T 세포 배양 TCM에 방지 하기 위해 IC 이전 4 h cytokine 분 비입니다. 그 당시, 단백질 생산을 유도 하기 위하여 50 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)와 500 ng/mL ionomycin T 세포 활성화. 문화의 37 ° C에서 4 h, 후 아래로, pipetting으로 문화 판에서 셀을 꺼내 려 하 고 원심 분리기 튜브 (15 또는 50 mL)에 전송. 세척 FB와 함께입니다. FB에 5 x 10 5 잘 당 3 x 10 6 세포의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 셀 resuspend. 얼룩 세포 생존 능력 (단원 4.2) 위에서 설명한 대로 염료. 부 화 후 접시 한 번에 씻어 FB. 표면 마커 검출을 위한 항 체를 다음과 같은 추가: 표면 마커 검출, 100 µ L의 FB CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 셀을 일시 중단 (복제 RM4-5). 선택적으로 B220에 대 한 항 체를 포함 (30-F11 복제) 및 CD11b (복제 m 1/70) 1: 100 희석 및 monocytes/대 식 세포, B 세포의 각각 게이팅 개선에. 일반적으로, PE Cy7 안티-CD4, FITC 안티-B220 및 PerCP Cy5.5 안티-CD11b 잘 작동합니다. 형광 색소의 항 체 어원이 같은 말의 분석을 위해 사용 될 흐름 cytometer의 구성에 의해 유도 해야 하 고 항 체의 최적 농도 실험적으로 결정 되어야 합니다. 얼음에 15-60 분 동안 품 어 FB와 함께 접시를 세척 하 고 얼음에 20 분에 대 한 고정/Permeabilization 솔루션의 200 µ L 셀 resuspend. 이 셀을 수정 하 고는 막 permeabilize. 세포내 얼룩 동안 세포 막의 permeabilization를 유지 하기 위해 FB 대신 파 마/워시 버퍼 (비밀 번호) (10 X 재고에서 희석된 1:10)를 사용 합니다. 비밀 번호의 200 µ L에 웰 스 워시. ICS에 대 한 인터페론 (IFN)에 대 한 항 체의 1: 100 희석 준비-γ와 IL-17A 1을 사용 하 여 x PW. 하나의 옵션은 APC 안티-IFN-γ (클론 XMG1.2) 및 PE 안티-일리노이-17A (클론 eBio17B7) 잘 작동. 세포내 항 체 칵테일의 100 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 적어도 15 분 동안 품 어. 그것도 하룻밤 4에서 얼룩이 계속 ° c. PW의 200 µ L에서 우물과 FB에 물의 resuspension cytometry에 대 한 세척. 병렬로 감지기 전압, 및 각 개별 형광 색소 (즉, 셀 또는 하나의 항 체/형광 색소로 얼룩진 보상 구슬)에 대 한 단일 스테인드 샘플을 최적화 하는 흠 없는 샘플 (항 체 없이 FB에 셀)을 준비 보상 좀 값 결정. 취득 교류 cytometer 사용 하 여, ≥에 가능한 (라이브/죽은-부정) CD4 게이팅 10000 셀 (이벤트), + 세포. T 세포의 정확한 게이팅 되도록 제외는 B220 + 및 CD11b + 세포 (B 세포, monocytes/대 식 세포, 각각). CD4 내 + T 세포 부분 모집단, IFN-γ (Th1 혈통) 또는 IL-17A (Th17 계보)를 표현 하는 셀의 비율을 결정. 6. 입양 전송의 병원 성 AQP4 전용 T 세포 참고:이 단계 섹션에서 다음과 같습니다: T 세포 문화와 proinflammatory T 세포 분극. 복구를 꺼내, 아래로 pipetting 50 mL 튜브에 전송 하 여 12-잘 접시에서 셀 편광. Ma주사까지 얼음에 intain. 셀 계산, 차가운 PBS에 두 번 세척 하 고 정지 1 x 10 8 셀/mL PBS에 준비. 일반적으로, 셀 시간 이내 주사. 부드럽게 소용돌이 의해 세포를 혼합 하 고 1 mL 주사기에 주입 시 전송. 관리 (2 x 10 7) 셀의 200 µ L 정 맥 (i.v.) 꼬리를 통해 각 마우스 정 맥. 주사 200 각 받는 사람 마우스 i.p. B. 백 일 해 독 소의 ng에 그 날 그리고 2 일 후 200 µ L의 PBS에 희석. 임상 질병의 표시를 위해 매일 마우스 모니터. 7. 임상 평가 ATCA CNS 면역의 임상 표시를 위해 매일 검사 받는 사람 마우스. 일반적으로 쥐 CNS 면역의 AQP4 전용 T 세포의 입양 전송 후 5-8 일 표시 됩니다. 쥐 신경 부전의 임상 증상이 나타납니다. 그것은 마우스의 정상적인 능력을 정의 하는 순진한 마우스에 평가 수행 하는 데 도움이. 평가 쥐 꼬리의 손실에 대 한 음색입니다. 꼬리의 기지에서 쥐를 부드럽게 잡고 고 똑바로 들어. 꼬리는 꼬리의 손실로 설명은 지속적으로 드 톤 (1의 점수). 꼬리의 손실은 종종 임상 질병의 첫번째 표시. 평평한 표면에 그것의 뒤에 마우스를 배치 하 여의 테스트 righting 반사 Truncal incoordination의 기호를은 느린 righting (2의 점수). 순진한 마우스 완전히 그래서 어떤 느려짐 오른쪽 능력에 역 기능으로 득점의 뒷면에 배치 하는 어떤 시도 저항할 것 이다. 일반적으로이 반사에 대 한 3-4 회 마우스 테스트. 평가 자세 그리고 ambulation입니다. 쥐 자세를 낮추는 결과로 또는 ambulation 동안 엉덩이의 드래그에 변화를 표시 하기 시작 (2.5의 점수). 또한 질병 결과 monoplegia, 한 뒷 다리의 완전 한 마비에에서 사지 (3.0의 점수) 및 하반신 마비, 두 뒷 다리의 전체 마비 사지 (3.5의 점수). 매우 느린 전진 운동에 온건한 quadraparesis, 모든 4 개의 사지의 약점 결과 (4의 점수). 심한 quadraparesis 수 거의 앞으로 운동 (4.5의 점수). 마지막으로, 심각한 질병을 가진 그들은 죽어가는 될 수도 (5의 점수) 죽을. 관리 마우스 또는 액체 또는 고체 식품 염 분 i.p. 포도 당 5%의 1 mL를 획득 하는 능력을 잃게 하는 액체로 사용 보충 탈수 및 음식 부족을 중화 컵, 높은 칼로리 젤과 베이컨 나왔던 젤. 죽어가는 쥐를 안락사. 8. 조직 준비 및 조직학 쥐 100 mg/kg 마 취 제와 10 mg/kg xylazine, Anesthetize 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀. 열기는 가슴을 노출 마음. 혈액 유출 허용 하도록 간 incise 나비 바늘 PBS와 10% 포 르 말린에 대 한 별도 저수지를 사용 하 여 miniflow 변속 펌프의 튜브에 연결 합니다. 심장의 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 뒤에 10% 포 르 말린의 25 mL PBS의 5 mL와 함께 perfuse. 머리 그리고 눈을 제거합니다. 프로세스 눈과 망막 앞에서 설명한 20. 눈 소켓을 가로질러, 코에서가 위를 삽입 하 고 각 측면에 후부 앞쪽 두개골을 잘라. 두개골을 제거, 노출 시 신경, 시 chiasm 잘라내어 2 거품 패드 사이 카세트에. 담가 10% 포 르 말린 (24 시간), 그리고 다음 50% 에탄올 (24 시간)에 70% 에탄올으로 다음 전송. 뇌와 척추를 제거 하 고 10% 포 르 말린에. 직렬 섹션 두뇌 코로나 비행기; 섹션 척추 코드에 화살 (약 절반) 및 직렬 코로나 비행기 (마우스 당 약 20 횡단면). 정기적으로 파라핀 포함에 대 한 프로세스 CNS 샘플입니다. 되며 고 오신 (시 신경) 또는 Luxol 빠른 블루 hematoxylin와 오신 (뇌와 척수) 8 µ m 두꺼운 부분 얼룩. 시 신경 염증 신경 및 주변 meninges (광 신경 염) 또는 주로 주변 meninges (광섬유 perineuritis)의 존재에 대 한 평가. Meningeal parenchymal 염증 foci 계산 (> 10 클러스터 된 단 세포) 각 마우스에 대 한 뇌와 척수 샘플에. 9. Vivo에서 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 이미징 망막 참고: 쥐의 스펙트럼 도메인 10 월 망막 이미징 일관 된 눈을 달성 하기 위해 상용 장비 (예를 들어, TruTrack 눈 추적기 Spectralis)를 사용 하 여 수행 오리엔테이션 및 모션 아티팩트를 줄일. 이미징, 이전 5 분 1 %tropicamide (눈 당 한 방울)과 눈동자를 팽창 하 고 당 분 (1.5 %isoflurane) 2 리터의 지속적인 흐름을 제공 하는 마 취 유도 실에서 이미지를 마우스. 열 매트 설정 하 고 준비 후 마 취 회복 케이지. 이미징 실린더에 마우스 놓고 마 취 흐름을 따라 이동 합니다. 0.3% 여기 스 눈을 축축한 유지 하 고 굴절 연속성을 보장 하기 위해 눈을 보호 합니다. 눈 검사에 사용자 지정 콘택트 렌즈 배치. 적외선 저 이미지에 의해 유도 빔 중심 시 신경 머리에 보장 눈에 레이저를 직접. 수직 및 수평 10 월 검사 망막 레이저에 수직 레이아웃 확인 해야 합니다. 고해상도 모드와 30에서 래스터화 수행 25 B-스캔 평균 A-스캔. 후 이미징 두 눈, 콘택트 렌즈를 제거 하 고 안과 젤을 적용. 따뜻한 복구 장에 마우스를 둡니다. 10. 처리 및 10 월의 분석 이미징 소프트웨어 자동된 분할에 대 한 모듈을 사용 하 여. 수동으로 올바른 세그먼트 내부 제한 막 (ILM)와 내부 plexiform 레이어 (IPL)에 해당, 안쪽 망막의 한계를 나타내는 레이어를 (IRL) 21. 망막 신경 섬유 층 (RNFL) 신경 절 세포 층 (GCL)는 IRL의 한계 내에서 거주 하 고 오버랩 되지 않는 확인 하십시오. 계산 IRL 두께 1, 2, 및 3 m m 광학 디스크에 스프레드시트 파일에 수출 중심의 직경을 가진 초기 치료 당뇨병 성 망막 증 연구 (ETDRS) 2 그리드를 사용 하 여. 소프트웨어는 각 그리드 부문 평균 하 여 각 망막 층의 두께 계산 합니다. 따라서, 시 신경 머리에 해당 하는 중앙 세그먼트는 제외 됩니다. 각 시간 지점에서 그룹 간의 통계적 차이 분석합니다. 일반화 추정 방정식 교환 상관 관계 매트릭스와 내부 주제 간 눈 상관 관계 21에 대 한 조정을 사용 하 여 각 마우스에 대 한 양쪽 눈 분석.