Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren
Summary
Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.
Abstract
Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und komplexen anatomischen Verhältnisse. Wie interagieren die Zellen mit ihren Nachbarn? Unterscheiden sich die Wechselwirkungen zwischen Zelltypen oder sogar innerhalb eines bestimmten Typs? Welche Arten von räumlichen Regeln folgen sie? Die Antworten auf solche grundlegenden Fragen in Vivo haben bisher durch einen Mangel an Tools für hochauflösende Einzelzelle Kennzeichnung behindert worden. Hier steht ein detailliertes Protokoll auf einzelne Zellen mit einer mehrfarbigen FlpOut (MCFO) Technik zur Verfügung. Diese Methode beruht auf drei unterschiedlich tagged Reporter (HA, Flagge und V5) unter FH-Kontrolle, die durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) still gehalten werden. Ein Hitze-Schock-Puls induziert die Expression von einer Hitze Schock-induzierte Flp Rekombinase, die nach dem Zufallsprinzip die FRT-Stop-FRT-Kassetten in einzelnen Zellen entfernt: Ausdruck tritt nur in Zellen, die auch einen GAL4-Fahrer zum Ausdruck bringen. Dies führt zu einer Reihe von unterschiedlich gefärbten Zellen von einem bestimmten Zelltyp, der die Visualisierung der einzelnen Zelle Morphologien in hoher Auflösung ermöglicht. Als Beispiel kann die MCFO Technik mit spezifischen Glia GAL4-Treibern, die Morphologien der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila zu visualisieren kombiniert werden.
Introduction
Glia, der nicht-neuronale Zellpopulation des Nervensystems (NS), waren lange geglaubt, um einen statischen Rahmen für Neuronen und wurden daher nicht im Detail untersucht. Jedoch beim Menschen, Glia bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in der NS (~ 90 %) und fallen in verschiedene Kategorien, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und Schwann-Zellen. In DrosophilaGlia sind etwa 10 % der Zellen in der NS. Faszinierenderweise sind ihren Morphologien und Funktionen bemerkenswert ähnlich denen in Wirbeltieren1,2. Ihre Morphologien gehören Blut – Hirn-Schranke (BBB) Epithelien, Ensheathing und Astrozyten-wie Zellen bilden.
Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus folgenden Grundstrukturen: Cortex-Regionen, die enthalten die neuronalen Zellkörpern; Neuropils, die synaptische Verbindungen zu beherbergen; kleine und große Axon Traktate, die die verschiedenen Neuropiles zu verbinden; periphere Nerven, die Sinnesorgane und Muskeln mit CNS (Abbildung 1) zu verbinden. Glia sind assoziiert mit diesen anatomischen Strukturen gefunden: Cortex Glia (CG) in den kortikalen Regionen, Astrozyten-ähnliche Glia (ALG) und Ensheathing Glia (EG) in den Neuropile Regionen, Ensheathing Glia sind auch zentrale Axon Traktate und peripheren zugeordnet Nerven (EGN), und schließlich zwei folienartigen Glia, perineurial Glia (PG) und subperineurial (SPG), die zusammen bilden eine zusammenhängenden Schicht, die die gesamte NS (Abbildung 2) abdeckt.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der NS; Sie überwachen neuronale Zelle Zahlen durch Reaktion auf systemisch zirkulierende Insulin-Like-Peptide, Neuronen, wie z. B. die Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle, trophische unterstützen und beseitigen sterbende Neuronen durch Phagozytose3,4 , 5 , 6. in die Reife NS Glia pflegen die BBB Neurotransmitter nehmen Ionischen Homöostase aufrechtzuerhalten, und fungieren als wichtigeren Immunzellen in der NS, da Makrophagen nicht die BBB verletzen und synaptische Aktivität sowie das Verhalten der Tiere6 moduliert , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Ob der glialen Subtypen spezialisierte Funktionen ausführen, bleibt eine wichtige offene Frage. Jedoch wurde eine systematische genomweite Analyse der Glia, vor allem bei den Erwachsenen, durch einen Mangel an geeigneten genetischen Tools für ihre Handhabung behindert. Hier ist eine Methode, die ermöglicht die effiziente und einfache Charakterisierung der Zellformen zu komplexen Zellezelle Interaktionen zu untersuchen präsentiert. Diese Technik wurde zur Charakterisierung der Morphologie der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila angewandt, aber abhängig von den jeweiligen GAL4-Treiber verwendet, es kann angepasst werden, um Neuronen12,13 studieren , jede Art von Vermischung Zellen und im Prinzip jedes Gewebe in alle Entwicklungsstadien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode, um die Morphologie der verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes von Interesse in hoher Auflösung zu studieren. Mit der MCFO Technik mehrere Reporter mit verschiedenen Epitop-Tags in Kombination multicolor stochastische Kennzeichnung (Abbildung 2) dienen. Ähnlich wie bei anderen Methoden wie Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO erhö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Arnim Jenett, Aljoscha Nern und anderen Mitgliedern des Rubin-Labors für Beratung und Austausch von unveröffentlichten Reagenzien und Janelia fliegen Licht Projektteam für konfokale Bilder zu erzeugen. Die Autoren danken auch die Mitglieder von Gallien Labor für Kommentare auf das Manuskript.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
Riferimenti
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