생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출
Summary
Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.
Abstract
Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.
Introduction
EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.
생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발광 영상 (BLI) 연구원 시각화 및 호스트 병원 체 상호 작용의 양자화에에서 있습니다 라이브 동물7. 씨 수 있습니다 그들은 이주와 다른 조직7; 침략 발광 박테리아에 따라 살아있는 동물에서 세균 감염 사이클 특성을 이 감염의 동적 진행을 보여준다. 또한, 동물에서 세균 부하는 관련이 발광 신호8; 따라서, 그것은 간단 하 고 직접적인 방법으로 실험 동물의 병 적인 상태를 추정 하는 편리한 표시기입니다.
여기에 사용 되는 플라스 미드 포함 luciferase 오 페론, luxCDABE, 박테리아 자체 luciferase 기판7,9인코딩하는 Photorhabdus luminescens 에서. 이 luciferase 표현 플라스 미드 박테리아로 변형 하 여 살아있는 동물에서 이러한 발광 박테리아를 관찰 하 여 식민과 감염 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 전반적으로, 씨 및 생물 발광 표시 된 박테리아 세균 숫자 및 위치, 항생제/치료 치료와 감염/식민지6, 에 세균성 유전자 발현 세균 생존 능력을 감시 하는 연구자 수 7. 수많은 병원 성 박테리아는 감염에서 감염 주기 및/또는 유전자 표현 검토 하 luxCDABE 오 페론 표현 보고 되었습니다. Uropathogenic 대장균10, EHEC8,11,,1213, enteropathogenic를 포함 하 여 이러한 박테리아 대장균 (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, 살 모 넬 라 typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, 비 브리 오 cholerae20, 문서화 되었습니다.
몇 가지 실험 모델 EHEC 식민 생체 외에서 그리고 vivo에서21,,2223의 연구를 촉진 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 공부 하기는 EHEC 식민 vivo에서, 적당 한 동물 모델의 부족 및 따라서 내용의 결과 소수 있다. EHEC 식민 메커니즘에는 vivo에서의 연구를 촉진 하기 위하여 관찰 하 고 계량 비-침략 적 방법에서 살아있는 동물에서 EHEC 식민 동물 모델을 구축 하는 귀중 한입니다.
이 원고는 EHEC 식민 생활 호스트에 시간이 지남에 따라 모니터 발광 표현 시스템을 사용 하는 마우스-EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 마우스는 intragastrically 생물 발광 표시 EHEC로 접종 하 고 발광 신호는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템13와 쥐에서 발견 되. 마우스 감염 생물 발광 표시 EHEC 2 일 게시 감염 후 2 일 게시 감염 호스트 창에 그 박테리아 식민지는 제안 후 그들의 내장에서 중요 한 발광 신호를 보여주었다. 이미지 데이터 비보 전 이 식민은 맹 쥐의 콜론에서 구체적으로 보여주었다. 이 마우스 EHEC 모델을 사용 하 여 발광 EHEC 식민 검출 될 수 있다 살아있는 호스트에는 vivo에서 이미징 시스템에서 더 이해를 증진 수 있습니다 장의 박테리아 식민지의 상세한 메커니즘을 연구 하 여 EHEC 유도 생리와 병리학 변화입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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