Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System
Summary
Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.
Abstract
Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) O157: H7, das ist ein durch Lebensmittel übertragene Erreger, Causesdiarrhea, hämorrhagische Kolitis (HS) und Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), um den Darm-Trakt des Menschen besiedeln. Um detaillierte Mechanismus der EHEC Kolonisation in vivo Studie unbedingt Tiermodellen zu überwachen und zu quantifizieren, EHEC Besiedlung haben. Wir zeigen hier ein Maus-EHEC Kolonisation Modell durch die Umwandlung der biolumineszenten mit dem Ausdruck ihrer Plasmids, EHEC zu überwachen und zu quantifizieren EHEC Kolonisation in lebenden Gastgeber. Tiere mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft zeigen intensive Biolumineszenz Signale bei Mäusen durch Erkennung mit einem nicht-invasive in Vivo imaging-System. Nach 1 bis 2 Tage-Infektion Post, konnte Biolumineszenz Signale noch bei infizierten Tieren nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass EHEC besiedeln in Gastgeber für mindestens 2 Tage. Wir zeigen auch, dass diese Biolumineszenz EHEC suchen, Maus Darm, speziell in den Blinddarm und Dickdarm, von Ex-Vivo -Bilder. Dieses Maus-EHEC Kolonisation Modell kann als ein Werkzeug, um das aktuelle Wissen des EHEC Kolonisation Mechanismus voraus dienen.
Introduction
EHEC O157: H7 ist ein Erreger, der Durchfall1, HS2, HUS3und sogar Akutes Nierenversagen4 durch verunreinigtes Wasser oder Lebensmittel verursacht. EHEC ist eine pathogene Enterobacterium und besiedelt mit dem Magen-Darm-Trakt des Menschen1. Wenn EHEC zunächst halten an Host Darmepithel, Spritzen sie die Kolonisation Faktoren in Wirtszellen durch die Typ III-Sekretion System (T3SS), das Funktionen wie ein molekularer Spritze induzieren eine Befestigung und auszulöschen (A/E) Läsion anschließend zur Durchsetzung Adhäsion (Kolonisation)5. Diese Gene in A/E Läsion Bildung beteiligt sind durch den Ort der Enterozyten Auslöschung (LEE) Pathogenität Insel5kodiert.
Biolumineszenz ist eine Licht-produzierende chemische Reaktion in die Luciferase seine Substrat Luciferin zum sichtbaren Licht6generieren katalysiert. Dieser enzymatischen Prozess erfordert oft das Vorhandensein von Sauerstoff oder Adenosintriphosphat (ATP)6. Biolumineszenz imaging (BLI) erlaubt Forschern, die Visualisierung und die Quantisierung der Wirt-Pathogen Interaktionen in lebenden Tieren7. BLI kann bakterielle Infektionszyklus mit lebenden Tieren charakterisieren, indem Sie die folgenden biolumineszenten Bakterien, wie sie zu migrieren und dringen in verschiedenen Geweben7; Dies zeigt eine dynamische Weiterentwicklung der Infektion. Darüber hinaus bezieht sich die bakterielle Belastung bei Tieren auf die Biolumineszenz Signal8; So ist es ein bequemer Indikator, die pathologischen Zuständen von Versuchstieren in eine einfache und direkte Weise zu schätzen.
Das hier verwendete Plasmid enthaltenen Luciferase Operon, LuxCDABE, die aus dem Bakterium Photorhabdus Luminescens , die eine eigene Luciferase Substrat7,9kodiert. Durch die Umwandlung dieser Luciferase exprimierenden Plasmid in Bakterien, können die Kolonisation und Infektion Prozesse überwacht werden, durch die Beobachtung dieser biolumineszenten Bakterien mit lebenden Tieren. Insgesamt erlauben BLI und Biolumineszenz-Label Bakterien Forschern, überwachen die bakterielle Zahlen und Lage, bakterielle Lebensfähigkeit mit Antibiotika-Therapie Behandlung und bakterielle Genexpression in Infektion/Kolonisation6, 7. zahlreiche Pathogene Bakterien gemeldet wurden, äußern, die LuxCDABE -Operon, deren Infektion Zyklus und/oder Gen-Ausdruck in Infektion zu untersuchen. Diese Bakterien, einschließlich adhärent E. Coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. Coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella Typhimurium16, Listeria Monocytogenes17, Yersinia Enterocolitica18,19, und Vibrio Cholerae20, dokumentiert wurden.
Einige experimentelle Modelle wurden entwickelt, um die Studie von EHEC Kolonisation in Vitro und in Vivo21,22,23zu erleichtern. Allerdings gibt es einen Mangel an geeigneten Tiermodellen, die EHEC Kolonisation in Vivozu studieren, und damit einen daraus resultierenden Mangel an Details. Um die Studie des EHEC Kolonisation Mechanismus in Vivozu erleichtern, ist es wertvoll, Tiermodellen zu beobachten und quantifizieren EHEC Besiedlung mit lebenden Tieren in eine nicht-invasive Methode zu bauen.
Dieses Manuskript beschreibt ein Maus-EHEC-Kolonisation-Modell, das eine Biolumineszenz mit dem Ausdruck ihrer System verwendet, um EHEC Kolonisation im Laufe der Zeit unter lebenden-Hosts zu überwachen. Mäuse sind intragastrically mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft und die biolumineszente Signal bei Mäusen mit einem nicht-invasive in Vivo imaging System13erkannt wird. Mäuse mit Biolumineszenz-Label EHEC zeigten signifikante Biolumineszenz Signale in ihrem Darm, nach 2 Tagen-Infektion, die vorgeschlagen Post, dass diese Bakterien im Darm Host kolonisiert, nach 2 Tagen-Infektion Post infiziert. Ex-Vivo Bilddaten zeigte, dass diese Kolonisierung speziell in den Blinddarm und Dickdarm von Mäusen. Mithilfe dieses Maus-EHEC-Modell kann die biolumineszente EHEC Kolonisierung erkannt werden im Leben Wirt durch ein in-Vivo imaging-System, um die detaillierten Mechanismen der magensaftresistenten Bakterien Kolonisation, zu untersuchen, die in weiteren Verständnis fördern kann EHEC-induzierte physiologische und pathologische Veränderungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurde berichtet, dass EHEC mit Luciferase Plasmid transformiert verwendet worden ist, um seine Lokalisierung in Hosts oder Gen Ausdruck in Vivo8,11,12zu untersuchen. Das Mausmodell demonstriert hier berichtet auch das EHEC kolonisiert Timing und die Lokalisierung in murinen Host8erkennen. Dennoch bieten wir das Detail-Protokoll wie EHEC Impfung Mäuse intragastrically verwalten und wie sorgfä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen Chi-Chung Chen von der Abteilung der medizinischen Forschung, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) für die Hilfe bei der Maus Infektion und die Unterstützung durch das Labor Animal Center der National Cheng Kung University. Diese Arbeit wird unterstützt durch den Minister für Wissenschaft und Technologie (MOST) gewährt (die meisten 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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