الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو
Summary
ويقدم بروتوكول مفصلاً نموذج الماوس ل enterohemorrhagic الاستعمار كولاي (الإشريكيّة) باستخدام البكتيريا المسماة الإضاءة الحيوية. يمكن المضي قدما الكشف عن هذه البكتيريا طرحه غير الغازية في فيفو التصوير النظام في الحيوانات الحية فهمنا الحالي لاستعمار القولونية.
Abstract
انتيروهيمورهاجيك كولاي (الإشريكيّة) O157:H7، الذي هو مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية التي كاوسيسديارهيا، التهاب القولون النزفي (النظام المنسق)، ومتلازمة يوريمي الانحلالي (HUS)، استعمار للامعاء للبشر. إلى دراسة مفصلة إليه القولونية الاستعمار المجراة، من الضروري أن لديها نماذج حيوانية لرصد وقياس الاستعمار القولونية. نظهر هنا نموذج استعمار القولونية ماوس عن طريق تحويل بلازميد تعرب عن طرحه القولونية لرصد وقياس الاستعمار القولونية في معيشة المضيفين. إظهار الحيوانات تلقيح مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية إشارات طرحه مكثفة في الفئران بالكشف مع غير الغازية في فيفو نظام التصوير. بعد أيام 1 و 2 مرحلة ما بعد الإصابة، إشارات طرحه يمكن لا يزال يتم الكشف عن في الحيوانات المصابة، مما يوحي بأن استعمار القولونية في المضيفين لمدة يومين على الأقل. نحن أيضا إثبات أن موقع هذه الإشريكيّة طرحه للامعاء الماوس، على وجه التحديد في الأعور والقولون، من صور السابقين فيفو . قد يعمل هذا النموذج الاستعمار القولونية الماوس كأداة للنهوض بالمعرفة الحالية لآلية الاستعمار القولونية.
Introduction
O157:H7 القولونية هو ممرض الذي يسبب الإسهال1، HS2،3من الحص، و الفشل الكلوي الحاد حتى4 عن طريق الأغذية أو المياه الملوثة. الإشريكيّة انتيروباكتيريوم المسببة للأمراض، وكولونيزيس إلى الجهاز الهضمي من البشر1. عندما القولونية أولاً الانضمام إلى المضيف ظهارة الأمعاء، أنها حقن عوامل الاستعمار في الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز الثالث نوع (T3SS) يعمل بمثابة حقنه جزيئي الذي يحفز إرفاق ويمحوا الآفة (A/E) فيما بعد لفرض الالتصاق (الاستعمار)5. يتم ترميز هذه الجينات المشاركة في تشكيل الآفة A/E بمحور enterocyte إغاراته (لي) الإمراضية الجزيرة5.
الإضاءة الحيوية رد فعل المواد كيميائية المنتجة للضوء، في لوسيفراس الذي يحفز به لوسيفرين الركيزة لتوليد الضوء المرئي6. وتتطلب هذه العملية الانزيمية غالباً وجود الأوكسجين أو الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)6. الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) يسمح الباحثين للتصور وتكميم التفاعلات المضيف الممرض في الحيوانات الحية7. ويمكنك تمييز BLI دورة العدوى البكتيرية في الحيوانات الحية باتباع هذه البكتيريا طرحه كما أنها تهاجر إلى غزو أنسجة مختلفة7؛ وهذا يكشف عن تطور ديناميكية للعدوى. وعلاوة على ذلك، يرتبط الحمولة البكتيرية في الحيوانات إلى إشارة طرحه8؛ وبالتالي، مؤشر مناسب لتقدير الظروف المرضية للحيوانات التجريبية بطريقة بسيطة ومباشرة.
بلازميد المستخدمة هنا يتضمن مشغل لوسيفراس، لوكسكدابي، ومن بكتيريا لومينيسسينس فوتورهابدوس أن ترميز الخاصة به الركيزة لوسيفراس7،9. بتحويل هذا بلازميد معربا عن لوسيفراس إلى البكتيريا، يمكن رصد عمليات الاستعمار والعدوى عن طريق مراقبة هذه البكتيريا طرحه في الحيوانات الحية. إجمالاً، BLI والبكتيريا المسماة الإضاءة الحيوية السماح للباحثين رصد أرقام البكتيرية والموقع وبقاء البكتيريا مع العلاج/العلاج بالمضادات الحيوية، والتعبير الجيني البكتيرية في استعمار العدوى/6، 7-قد تم الإبلاغ عن العديد من البكتيريا المسببة للأمراض أن نعرب عن مشغل لوكسكدابي لفحص تعبيرها دورة و/أو الجينات الإصابة بالعدوى. هذه البكتيريا، بما في ذلك أوروباثوجينيك كولاي10، الإشريكيّة8،11،،من1213، انتيروباثوجينيك كولاي (أبيك)8، المضادات رودينتيوم،من1415، typhimurium السالمونيلا16، الليستريه المستوحدة17، واليرسينيا انتيروكوليتيكا18،19، و20من الكوليرا، وقد وثقت.
وضعت عدة نماذج تجريبية لتسهيل دراسة القولونية الاستعمار في المختبر و في فيفو21،،من2223. ومع ذلك، هناك نقص في نماذج حيوانية مناسبة لدراسة الإشريكيّة الاستعمار في فيفو، وبالتالي قلة الناتجة من التفاصيل. لتسهيل دراسة الإشريكيّة الاستعمار إليه في فيفو، أنها ذات قيمة لبناء نماذج حيوانية لمراقبة وقياس الاستعمار القولونية في الحيوانات الحية في طريقة غير الغازية.
ويصف هذه المخطوطة نموذج استعمار القولونية ماوس يستخدم نظام تعرب عن طرحه لمراقبة الإشريكيّة الاستعمار على مر الزمن في معيشة المضيفين. إينتراجاستريكالي يتم تلقيح الفئران مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية وتم الكشف عن إشارة طرحه في الفئران مع غير الغازية في فيفو التصوير النظام13. الفئران المصابة مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية أظهرت إشارات طرحه كبيرة في الأمعاء بهم بعد يومين بعد الإصابة، مما يوحي بأن المستعمر هذه البكتيريا في الأمعاء المضيف بعد يومين بعد الإصابة. السابقين فيفو بيانات الصورة أظهرت أن هذا الاستعمار على وجه التحديد في الأعور والقولون من الفئران. باستخدام هذا النموذج القولونية الماوس، يمكن اكتشاف استعمار القولونية طرحه في المضيف المعيشة في فيفو نظام، لدراسة آليات تفصيلية لاستعمار البكتيريا المعوية، التي قد تشجع على زيادة فهم في التصوير التغيرات الفسيولوجية والمرضية التي يسببها القولونية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأفيد أن تتحول مع بلازميد لوسيفراس القولونية قد استخدمت لدراسة عن التعريب في المضيفين أو مورثة تعبير في فيفو8،،من1112. كما أبلغ نموذج مورين تظاهروا اليوم للكشف عن توقيت القولونية المستعمر والتعريب في المضيف مورين8. ومع ذل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف تشن تشونغ تشي من إدارة “البحوث الطبية”، المركز الطبي لمي تشي (تاينان، تايوان) للمساعدة في الماوس العدوى، والدعم المقدم من مركز جامعة تشينغ كونغ الوطنية الحيوانات المختبرية. هذا العمل معتمد من قبل “وزير العلوم” والتكنولوجيا (معظم) يمنح (الأكثر 104-2321-ب-006-019، 105-2321-ب-006-011،-005 and106-2321-ب-006) CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
Riferimenti
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
