Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın
Summary
Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.
Abstract
Vivo mikroenjeksiyon bireysel sivrisinekler gen işlevlerinde analiz etmek için en sık kullanılan gen transferi tekniği var. Ancak, bu yöntem teknik olarak işlem talep daha fazla gerektirir ve karmaşık prosedürler, özellikle onların küçük büyüklük, nispeten ince ve kırılgan manikür ve yüksek mortalite, uygulama sınırı nedeniyle larva kullanıldığında içerir. Buna ek olarak, viral vektörler gen teslim için hücre içi ve hücre dışı engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Bu sistemlerin avantajları kolayca idare, yüksek gen iletim verimlilik, uzun vadeli bakım gen ekspresyonu ve kalıcı etkileri in vivoüretmek için yeteneği var. Sivrisinek densoviruses (MDVs) yabancı nükleik asitler sivrisinek hücrelere etkin bir şekilde sunabilir, sivrisinek özel, küçük tek iplikçikli DNA virüsler vardır; Ancak, değiştirme veya ekleme rekombinant virüsler genellikle oluşturmak için yabancı genlerin bu virüsler geliştirme olarak teslim vektörel çizimler için bir engel olan ambalaj ve/veya çoğaltma yeteneklerini kaybolmasına neden olur.
Burada, bir kusurlu rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için bir yapay intronic küçük-RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve kantitatif analiz rAaeDV vektörlerin ve larva enfeksiyon için ayrıntılı yordamlar açıklanmıştır.
Bu çalışmada gösterilmiştir, ilk kez, bir kusurlu rekombinant MDV Mikro RNA (miRNA) ifade sistem, geliştirmek ve böylece sivrisinek genlerin fonksiyonel analiz için güçlü bir araç sağlayarak ve için bir temel kurulması fizibilite Sivrisinek kaynaklı hastalıklar kontrol etmek için viral paratransgenesis uygulanması. Biz Aedes albopictus 1st INSTAR larva kolay ve etkili virüs sitesi ıslahı larva su vücuda getirerek enfekte olabilir ki ve gelişmiş rAaeDVs overexpress veya yıkmak için kullanılan olabilir gösterdi larvalar, genler sivrisinek fonksiyonel analiz için bir araç sağlayan bir belirli hedef geni ifadesidir.
Introduction
Sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıklar gibi sıtma, Dang Humması, zika ateş ve sarı humma, küresel bulaşıcı hastalık yükü1,2önemli bir kısmı için hesap devam başlıca uluslararası halk sağlığı sorunları vardır. Yanıt vektörel çizimler olarak kullanılmıştır, geleneksel böcek sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların önlenmesi için sürdürülebilir entegre sivrisinek denetimi stratejisi önemli bir bileşeni vardır. Ancak, bu stratejileri nispeten etkisiz veya ilişkili olumsuz çevresel etkilerin yanı sıra sivrisinek nüfus3,4direnç gelişimi nedeniyle istenmeyen olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, denetim ve steril erkek sivrisinekler üretmek için transgenik yöntemleri sivrisinek alternatif yöntemler için acil bir ihtiyaç olduğunu ve patojen dayanıklı sivrisinekler sürümü umut verici yeni kontrol stratejileri ortaya çıktığı. Geliştirmek için etkili yeni kontrol yöntemleri, gibi güvenli ve etkili yaklaşımlar içinde vivo gen teslim, sivrisinek gen işlevi kapsamlı analiz için gerekli.
Plazmid DNA, çift doğrudan mikroenjeksiyon RNA (dsRNA) telli veya küçük müdahale RNA (siRNA) en sık kullanılan vivo içinde gen teslim sivrisinekler yöntemidir. Aslında, sivrisinekler transgenik suşları üretimi hala embriyo mikroenjeksiyon5,6,7göreve güvenmek. Ancak, mikroenjeksiyon bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu teknik teknik olarak talep ediyor ve karmaşık prosedürler içerir. İkinci olarak, enjeksiyon embriyo, larva, Pupa ve yetişkin, hedef organizmanın canlılığı doğrudan etkileyen fiziksel bir hakaret neden olur. Üçüncü olarak, çünkü çoğu bir su ortamında yaşıyor ve hareket kıvranma karakteristik sahip sivrisinek larva mikroenjeksiyon için immobilize etmek zordur. Dördüncü olarak, 1st-2nd INSTAR larva boyutunu daha küçük 4th bundan daha hassas biçim ve büyük larva ve cuticles eski 10 – için 20 – kat. Bu özellikler 1st-2nd INSTAR larva bu büyük aşamaları ile karşılaştırıldığında işlemek zorlaştırır. Birlikte, bu faktörlerin bir düşük sonrası enjeksiyon sağkalım oranı yetişkin8‘ e göre larva (yaklaşık % 5) için katkıda bulunur. Viral tabanlı dağıtım sistemleri ilgili ekstraselüler ve hücre içi önündeki engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Bu sistemlerin avantajları kolayca idare, yüksek iletim verimliliği, uzun vadeli ve sağlam düzeyleri ifade ve kalıcı etkileri in vivoüretmek için yeteneği var. Bu nedenle, gen teslim Retrovirüsler, lentiviruses ve adenovirüse bakın sistemleri yaygın olmuştur inmammalian hücre satırları ve modeli tür kullanılır. Sindbis viral ifade sistem daha önce yetişkin sivrisinek gen işlevinde analiz etmek için kullanılmıştı; Biyogüvenlik endişeleri yanı sıra, ancak, enjeksiyon hala viral enfeksiyon9için gerekli bir süreç olduğunu. Her ne kadar larva dsRNA çözümünde iliklerine tarafından sözlü teslim daha önce uygun Teslimat yöntemi olarak bildirilmiştir, küçük RNA işlev analiz10için uygun değildir. Yani, etkili viral teslim yöntemleri hala sivrisinekler için geliştirilmelidir.
Sivrisinek densoviruses (MDVs) Densovirinae alt Parvoviridaeve biri dışında tüm sonbahar Brevidensovirus11cins içinde yer almaktadır. MDV virions sigara saran ve tek iplikçikli DNA (ssDNA) genom ve icosahedral bir kapsid oluşur (20 nm çapında). Viral genom yaklaşık 4 KB içinde büyüklük ve konak hücre çekirdeği içinde çoğaltılır. MDVs ortamında nispeten istikrarlı ve sivrisinekler için yüksek özgüllük ile dar ana bilgisayar aralığını gösterir. Bu virüs yaymak ve doğal olarak sivrisinek nüfus devam potansiyeline sahip ve hemen hemen tüm organ ve dokulara midgut, Malpighi tübüllerin, yağ vücut, kas, sinir hücreleri ve tükürük bezleri12de dahil olmak üzere bu böceklerin istila edebilir.
Sağlam MDV genleri plazmid vektörel çizimler bulaşıcı klonlar plazmid tabanlı üretmek için subcloned; Bu klonlar sivrisinek hücrelere teslim edildiğinde, viral genom plazmid öğesinden elde edilir ve bulaşıcı viral parçacıkların üretilmektedir. MDV küçük ssDNA genom olduğundan, bulaşıcı klonlar kolayca inşa edilir ve viral genom kolay elde edilebilir11,13olabilir. Bu özellikleri MDV sivrisinek Biyoloji incelenmesi için değerli bir ajan olun. Neredeyse tüm viral genom dizisinin viral yayılması için gerekli olduğundan, ancak, rekombinant virüs-den geçerek yedek oluşturma veya ekleme yabancı genlerin viral yeteneklerine, ambalaj ve/veya çoğaltma oluşturur kaybolmasına neden olur bir bariyer MDVs kalkınma olarak gen teslim vektörel çizimler. Burada, biz kolay plazmid inşaat avantajları ve üretebilir işlevsel bir virüs bakım olan bir arızalı olmayan rAaeDV vivo içinde RNA teslim sistemi geliştirmek için bir yapay intronic küçük-RNA ifade strateji kullanarak raporu konak hücreleri vahşi-tipi virüs gerek kalmadan istikrarlı ve uzun vadeli ifade. Ayrıca, bu yöntem larva kolay iletim için sağlar.
Bu çalışmada iletişim kuralları için aşağıdaki adımları açıklanmıştır: 1) rAaeDVs bir intronic küçük-RNA ifade kaset, 2) üretim rekombinant virüs partikülleri C6/36 ambalaj hücre kullanarak kodlama tasarımını satır, boş hücre, kantitatif analiz 3) rAaeDV genom kopya numaraları ve 4) Ae. albopictus larva tarafından virüs doğrudan giriş larva Habitat su vücuda bir enfeksiyon. Genel olarak, bu eser belirli küçük RNA’ların veya hedef genlerin olabilir overexpressed veya gelişmiş MDV dağıtım sistemini kullanarak sivrisinek larva içinde yere serdi olduğunu gösterdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki rAaeDV inşaat sınırlamak önemli engelleri aşmak önemlidir. İlk arızalı rekombinant virüs yapımıdır. Bu uygun bir şekilde ifade etmek için bir vektör Akrep böcek özgü neurotoxins20 ve GFP protein gibi yabancı genlerin boyutlu gibi MDV kullanılabilir bildirilmiştir; MDV ORFs eklenen veya değiştirilen eksojen genler ile bir kez yardımcı plazmid eksik vazgeçilmez viral proteinler sağlamak için cotransfected sürece ancak, inşaat strateji ne olursa olsun, virions bağımsız olarak oluşamı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin mali desteği kabul için Xiao-Guang Chen (2016YFC1200500), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81672054 ve 81371846), araştırma ekibi programı doğal Guangdong (2014A030312016) temeli bilim ve bilimsel ve teknolojik programı Guangzhou (201508020263). Minnetle Profesör Jonathan Carlson (Colorado State University) lütfen çekim ve p7NS1-GFP plazmidleri sağlamak için ve eleştirel okuma bu el yazması için anıyoruz.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Riferimenti
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
