Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

As cianobactérias acumulam glicogênio como a principal reserva de carboidratos de carbono do CO ₂ fixado na luz através da fotossíntese. O glicogênio é um glicano constituído por glucano linear a-1,4-ligado com ramos criados por ligações de glucosilo ligadas a a-1,6. A biossíntese de glicogênio em cianobactérias começa com a conversão de glicose-6-fosfato em ADP-glicose através da ação seqüencial da fosfoglucomutase e da pirofosforilase de ADP-glicose. A fração de glicose em ADP-glucose é transferida para a extremidade não redutora do esqueleto a-1,4-glucano do glicogênio por uma ou mais sintases de glicogênio (GlgA). Posteriormente, uma enzima de ramificação introduz a ligação de glucosilo ligada a a-1,6, que é ampliada para gerar a partícula de glicogênio. No escuro, o glicogênio é dividido por glicogênio fosforilase, enzimas de desmantelamento de glicogênio, α-glucanotransferase e malto-dextrina fosforilase em glicose fosforilada e glicose livre. Esses feed intOu caminhos catabólicos, incluindo a via oxidativa de fosfato de pentose, a via de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólise) e a via Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

O metabolismo de glicogênio em cianobactérias aumentou o interesse nos últimos anos devido ao potencial de cianobactéria se desenvolver em fábricas de células microbianas conduzidas pela luz solar para produzir produtos químicos e combustíveis. O metabolismo do glicogênio pode ser modificado para aumentar o rendimento dos produtos, porque o glicogênio é o maior grupo de carbono flexível dessas bactérias. Um exemplo é a cianobactéria Synechococcus sp. PCC 7002, que foi manipulado geneticamente para produzir manitol; A interrupção genética da síntese de glicogênio aumenta o rendimento de manitol 3 vezes ⁵ . Outro exemplo é a produção de bioetanol a partir de cargas carregadas com glicogênioYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . O conteúdo de glicogênio celular de tipo selvagem pode ser até 60% do peso seco da célula durante a fome de nitrogênio ⁶ .

Nossa compreensão do metabolismo e regulação do glicogênio também se expandiu nos últimos anos. Enquanto o glicogênio é conhecido por se acumular na luz e ser catabolizado no escuro, a cinética detalhada do metabolismo do glicogênio durante o ciclo diel foi revelada apenas recentemente em Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Além disso, vários genes que afetam a acumulação de glicogênio foram identificados. Um exemplo notável é a descoberta de que a putativa histidina quinase PmgA e o RNA PmgR1 não codificante formam uma cascata regulatória e controlam o acúmulo de glicogênio. Interessantemente, os mutantes de deleção e PMGA pmgR1 acumular duas vezes mais glicogénio como a estirpe de tipo selvagem de Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Outros elementos reguladores também são conhecidos por afetar o acúmulo de glicogênio, incluindo o fator de sigma alternativo E e o fator de transcrição CyAbrB2 ^{10 , 11} .

À medida que o interesse na regulação do glicogênio e no metabolismo cresce, um modelo detalhado que descreve a determinação do conteúdo de glicogênio é garantido. Vários métodos são usados ​​na literatura. A hidrólise ácida seguida pela determinação do teor de monossacarídeos através de cromatografia líquida de permuta aniónica de alta pressão acoplada a um detector amperométrico pulsado ou a uma determinação espectrométrica após tratamentos com ácido e fenol são métodos amplamente utilizados para aproximar o teor de glicogênio ^{9 , 10 , 12 , 13} . No entanto, uma cromatografia líquida de permuta de aniões de alta pressãoO instrumento c é muito caro e não discrimina a glicose derivada do glicogênio da derivada de outros glicoconjugados contendo glicose, tais como sacarose ¹⁴ , glucosilglicerol ¹⁵ e celulose ^{16 , 17 , 18} , que são conhecidos por se acumularem em algumas espécies de cianobactérias. O método ácido-fenol pode ser realizado utilizando equipamento de laboratório padrão. No entanto, ele usa reagentes altamente tóxicos e não distingue a glicose derivada de diferentes glicoconjugados, nem distingue a glicose de outros monossacarídeos que constituem materiais celulares, como glicolípidos, lipopolissacarídeos e matrizes extracelulares ¹² . Notavelmente, o ensaio a quente de ácido-fenol é freqüentemente usado para a determinação do teor total de carboidratos em vez de para a determinação específica do teor de glicose ¹² . Enzymatic hyA hidrólise de glicogênio em glicose pela α-amiloglucosidase seguida da detecção de glicose através de um ensaio acoplado a enzima gera uma leitura colorimétrica altamente sensível e específica à glicose derivada de glicogênio. A especificidade pode ser melhorada ainda mais com a precipitação preferencial de glicogênio a partir de lisados ​​celulares pelo etanol ^{5 , 8 , 19} .

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um ensaio baseado em enzimas do teor de glicogênio em duas das espécies cianobacterianas mais estudadas, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nas variedades de tipo selvagem e mutante. A fim de assegurar a hidrólise eficiente, é utilizado um cocktail de α-amilase e α-amiloglucosidase ⁸ . A α-amilase de ação endo hidroliza as ligações a-1,4 em vários glucanos em dextrinas, que são ainda hidrolisadas tO glicose por α-amiloglucosidase ^{20 de} ação exo. Os efeitos sinérgicos destas enzimas são bem conhecidos, e essas enzimas são rotineiramente usadas para a hidrólise seletiva do amido, que é um glucano semelhante a um glicogênio, sem afetar outros glicoconjugadores, como a celulose, na biomassa vegetal ²¹ . A glicose liberada é detectada quantitativamente após um ensaio acoplado a enzima consistindo em glucose oxidase – que catalisa a redução de oxigênio para peróxido de hidrogênio e a oxidação da glicose para uma lactona e peroxidase – que produz um corante de quinoneimina cor de rosa de peróxido de hidrogênio, Um composto fenólico e 4-aminoantipirina ²² .