窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質¹の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。

タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ²に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核³を破壊できる、膜バインド リソソーム⁴のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate⁵を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。

しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。

窒素のキャビテーションは 1960 年代⁶以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold⁷は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備^8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備^10、11、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (> 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。