Detta arbete beskriver ett protokoll för kromatinimmunutfällning (ChIP) med en mogen T-cellinje från mus. Detta protokoll är lämpligt för att undersöka fördelningen av specifika histonmarkeringar vid specifika promotorställen eller genom-hela.
Signalvägar reglerar genuttrycksprogram via modulering av kromatinstrukturen vid olika nivåer, såsom genom post-translatoriska modifieringar (PTM) av histon-svansar, utbyte av kanoniska histoner med histonvarianter och nukleosomutsättning. Sådan reglering kräver bindning av signalkänsliga transkriptionsfaktorer (TFs) som rekryterar kromatinmodifierande enzymer vid regulatoriska element definierade som förstärkare. Förstå hur signalkaskader reglerar förstärkningsaktivitet kräver en omfattande analys av bindningen av TF, kromatinmodifierande enzymer och beläggningen av specifika histon-märken och histonvarianter. Kromatinimmunutfällning (ChIP) -analyser använder högspecifika antikroppar för immunoprecipitering av specifika protein / DNA-komplex. Den efterföljande analysen av det renade DNA möjliggör identifieringen av regionen som upptas av proteinet som känns igen av antikroppen. Detta arbete beskriver ett protokoll för att effektivt peRform ChIP av histonproteiner i en mogen T-cellinje av mus. Det presenterade protokollet möjliggör utförandet av ChIP-analyser i en rimlig tidsram och med hög reproducerbarhet.
Utveckling, differentiering och homeostas beror på specifika genuttrycksprogram som etableras genom att signalera händelser som modulerar kromatinstrukturen och bestämmer därför om en specifik gen aktiveras eller undertrycks på ett cell- och tidsspecifik sätt. Under T-cellutveckling måste specifika genuttrycksprogram fastställas för att korrekt bestämma mognad av T-cellprekursorer från dubbel-negativ (DN) till det enda positiva (SP) tillståndet, som passerar genom flera mellanliggande steg 1 . Hur genuttrycksprogrammet regleras dynamiskt under T-cellutveckling har i stort sett undersökts tidigare år av flera laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Genom post-translationella modifieringar (PTM) av histoner, utbytet avKanoniska histoner med histonvarianter, nukleosomutsättning och DNA-metylering reglerar ON / OFF-omkopplaren av gener. Flera grupper har undersökt genomfördelningen av PTM och histonvarianter för att bestämma märken som är associerade med olika kromatintillstånd i både proximala och distala regulatoriska regioner 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerar dynamisk kromatinreglering via utbytet av positiva och negativa kromatinmodifierande enzymer (även kända som kromatinmodifierare) vid specifika förstärkningselement. Dessa kromatinmodifierare reglerar kromatinstrukturen och således transkriptionsutmatningen genom exempelvis dynamisk histon-metylering och acetylering. Detta är fallet i Notch-signalvägen 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiska histon PTM; Utbyten med histonvarianter; Och den dynamiska beläggningen av histoner, transkriptionsfaktorer och kofaktorer kan undersökas genom kromatinimmunutfällning (ChIP) analyser. Mycket specifika antikroppar används för att rena specifika DNA-proteinkomplex, och det renade DNAet analyseras med kvantitativ PCR (qPCR); Djup-sekvensering (ChIP-Seq); Eller, mindre ofta, hybridisering till mikroarray (ChIP-ChIP).
ChIP-analyser utmanar ibland på grund av komplikationer med cellens lyser, skjuvning av kromatinet och / eller låg specificitet hos antikropparna. Flera strategier har antagits för att förbättra protokollet, vilket är fallet för NEXSON 15 . Användningen av kylvattenbadkarikatörer undviker provuppvärmning som kan skada epitoperna som är närvarande på proteinet som undersöks, men den energi som krävs för skärning av proverna dispergeras i vattnet.En annan förbättring gjordes med utvecklingen av fokuserade ultraljudsanordningar som förhindrar dispersionen av energin. Därför möjliggör fokuserade ultraljudsanordningar förbättringar i celllys och kromatinskärning, eliminering av operatörinducerade variationer och signifikant ökande reproducerbarhet.
I det här arbetet beskrivs ett protokoll (schematisk översikt i Figur 1 ) för att effektivt utföra ChIP av histonproteiner i en mogen T-cellinje, kallad E2-10HA 16 , 17 . T-celler är vanligtvis svåra att lysera, och skjuvningen av deras kromatin har visat sig vara ineffektiv. I detta protokoll, som utnyttjar en kylfokuserad ultraljudsapparat, optimerades antalet celler, lysisbufferten och skärningsinställningen för E2-10HA-mus-T-cellinjen. Detta protokoll låter en utföra ChIP med hög reproducerbarhet och inom rimlig tid. Faktum är att det kräverÄr ungefär två dagar för att skjuva kromatinet och att utvärdera skjuvans kvalitet och tre dagar för att utföra immunutfällningen, reversera tvärbindningen och rena DNA.
ChIP är en giltig teknik för att undersöka huruvida proteiner eller deras PTMs berikas vid specifika genomiska regioner. ChIP-analysresultat är ofta utmanande att tolka på grund av biologiska eller tekniska skäl. De biologiska orsakerna är mångfaldiga och inkluderar svag eller indirekt bindning av proteiner till DNA. Det finns också tekniska begränsningar, såsom begränsad antikroppsspecificitet och ineffektiv celllys eller kromatisk skjuvning. En felsökningsguide ( tabell 5 ) kan hjälpa läsaren att lösa de problem som kan uppstå med ChIP-analyser.
Detta protokoll, som utnyttjar en kylfokuserad ultraljudsapparat, möjliggör en effektiv skjuvning av kromatinet hos en mogen T-cellinje från mus. Protokollets huvudsakliga kritiska steg representeras av skjuvningen av kromatinet, vilket alltid måste optimeras för varje celltyp. Det föreslås att man varierar antalet celler och antalet sonikationscykler. Dessutom, hon Aring effektivitet påverkas negativt av närvaron av SDS-fällningar i proven, som kan bildas under lysis av cellerna på is med SDS lysisbuffert. I detta fall är det bäst att inkubera provet efter lysering vid rumstemperatur i några minuter för att minska förekomsten av SDS-fällningar. Det rekommenderas att optimera protokollet för att erhålla skjuvade fragment mellan 200 och 500 bp och att alltid utvärdera skjuvkvaliteten hos proverna innan de fortsätter med immunutfällningen. Dessutom måste fixeringstiden, mängden antikropp och / eller celler och tvättbetingelserna optimeras för varje antikropp.
Ett mer kritiskt steg för att lyckas med ett ChIP-förfarande är valet av antikroppen, eftersom antikroppar med låg specificitet minskar immunförstörelsens effektivitet avsevärt. Tidigare tillåtes ett enhetligt kvalitetsprov för utvärdering av specificiteten hos flera antikroppar tillgängliga på marknaden Ss = "xref"> 19. Screeningsrörledningen baserades på dot blot, Western blot och ChIP, vilket gav en lista över högkvalitativa reagenser lämpliga för ChIP 19 . Mer nyligen utvärderades specificiteten hos flera kommersiellt tillgängliga antikroppar med användning av histonpeptid-mikroarrayplattformar med hög densitet, vilket möjliggör etablering av en databas om antikroppsspecificitet 20 . Läsaren kan använda detta användbara verktyg för att identifiera de mest specifika antikropparna som kan användas för ChIP-experiment.
Detta protokoll har inte testats för primära T-celler och i detta fall bör läsaren hänvisa till andra publicerade protokoll som framgångsrikt utför ChIP på primära T-celler 3 , 4 , 21 . I synnerhet har detta protokoll framgångsrikt använts för att utföra ChIP på en T-cellinjen för musprogenitor, såväl som på en endotelcellcellinje.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler ska användas för varje immunutfällning för analys av histonmarkeringar. Eftersom detta protokoll också kan vara lämpligt, med viss optimering, för att utföra ChIP på TFs eller kofaktorer, är det bäst att öka antalet celler Används för immunutfällningen i dessa fall. För att nå det erforderliga antalet celler för varje experiment kan fler alikvoter av skjuvat lysat sammanfogas innan förtunning av kromatinet i utspädningsbufferten.Detta protokoll kan också modifieras för att utföra ChIP på endogena proteiner som inte binder direkt till DNA. I detta fall kan förfixering med protein-protein-tvärbindningsmedel ( t.ex. dimetyladipimidat, DMA) krävas (se bilaga B för mer information). Den framgångsrika utförandet av ChIP på kofaktorer gjordes tidigare genom att överuttrycka proteiner som är smälta till en biotin-tagg. I detta fall renades proteinet med streptavidin-conjugaMagnetiska pärlor, och en förfixering med DMA utfördes 22 .
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för P. Käse och T. Schmidt-Wöll för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av det samarbetsforskningsbidrag TRR81 och Heisenbergprogrammet (BO 1639 / 5-1) från DFG (German Research Foundation), Max Planck Society och EXC 294 i Freiburg och Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen till TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |