يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.
وتقوم مسارات التشوير بتنظيم برامج التعبير الجيني من خلال تشكيل بنية الكروماتين على مستويات مختلفة، مثل التعديلات بعد متعدية (تي تي أم) لتيول هيستون، وتبادل الهيستونات المتعارف عليها مع المتغيرات هيستون، وإخلاء النيوكليوسومات. يتطلب هذا التنظيم ملزمة لعوامل النسخ الحساسة للاشارات (تفس) التي تجنيد الانزيمات تعديل الكروماتين في العناصر التنظيمية التي تعرف بأنها المعززات. فهم كيفية تنظيم شلالات تنظيم نشاط محسن يتطلب تحليل شامل لربط تفس، الكروماتين تعديل الإنزيمات، وإشغال علامات هيستون محددة والمتغيرات هيستون. المقايسات المناعية (رقاقة) الكروماتين استخدام أجسام مضادة محددة للغاية ل إيمونوبريسيبيتات بروتين معين / المجمعات دنا. تحليل لاحق من الحمض النووي المنقى يسمح لتحديد المنطقة المحتلة من قبل البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة. يصف هذا العمل بروتوكول ل بي كفاءةتشوه، بسبب، هيستون، بروتينز، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إنضج، الفأر، T-سيل، سطر. بروتوكول عرض يسمح لأداء المقايسات رقاقة في إطار زمني معقول ومع استنساخ عالية.
تعتمد التنمية والتمايز والتوازن على برامج التعبير الجيني محددة التي يتم إنشاؤها من خلال إشارات الأحداث التي تعدل بنية الكروماتين، وبالتالي تحديد ما إذا كان يتم تنشيط جين معين أو قمعها بطريقة الخلية والوقت المحدد. خلال تطوير الخلايا التائية، يجب إنشاء برامج التعبير الجيني محددة لتحديد نضوج السلائف خلية T من السلبي المزدوج (دن) إلى حالة إيجابية واحدة (سب)، يمر عبر عدة مراحل وسيطة 1 . كيف تم تنظيم برنامج التعبير الجيني ديناميكيا خلال تطوير الخلايا التائية تم التحقيق على نطاق واسع في السنوات السابقة من قبل العديد من المختبرات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 .
عن طريق التعديلات بعد متعدية (بتمس) من الهيستونات، وتبادلهيستونيس الكنسي مع المتغيرات هيستون، الطرد نوكلأوسوم، ومثيلة الحمض النووي تنظم التبديل أون / أوف من الجينات. وقد حققت عدة مجموعات في توزيع الجينوم على نطاق واسع من بتمس والمتغيرات هيستون لتحديد العلامات التي ترتبط مع مختلف دول الكروماتين في كل من المناطق التنظيمية القريبة والبعيدة 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تشوير الشلالات تنظيم تنظيم كروماتين الديناميكي عن طريق تبادل الإيجابية والسلبية إنزيمات تعديل الكروماتين (المعروف أيضا باسم معدلات الكروماتين) في عناصر محسن محددة. هذه المعدلات لونين تنظيم هيكل الكروماتين، وبالتالي الناتج النسخي من قبل، على سبيل المثال، مثيلة هيستون الديناميكي والأستيلاتيون. هذا هو الحال في مسار إشارات الشق 11 ، 12 ، 13 ،14 –
ديناميكية هيستون بتمس. التبادلات مع المتغيرات هيستون. وإمكانية الإشغال الديناميكي للهيستونات، عوامل النسخ، والعوامل المساعدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات المناعية (رقاقة) لونين. وتستخدم الأجسام المضادة محددة للغاية لتنقية المجمعات الحمض النووي البروتين محددة، ويتم تحليل الحمض النووي المنقى عن طريق ير الكمية (قر). تسلسل عميق (تشيب-سيق)؛ أو أقل تواترا في الوقت الحاضر، التهجين ل ميكروأري (رقاقة رقاقة).
مقايسات رقاقة في بعض الأحيان تحديا بسبب المضاعفات مع تحلل الخلايا، القص من لونين، و / أو خصوصية منخفضة من الأجسام المضادة. وقد اعتمدت عدة استراتيجيات لتحسين البروتوكول، كما هو الحال بالنسبة إلى نيكسون 15 . استخدام التبريد سونيكاتورس حمام المياه يتجنب عينة التدفئة التي قد تلحق الضرر الحواتم الموجودة على البروتين قيد التحقيق، ولكن الطاقة المطلوبة لقص العينات يحصل فرقت في الماء.تم إجراء تحسين آخر مع تطوير أجهزة أولتراسونيكاتيون تركز التي تمنع تشتت الطاقة. ولذلك، تركز أجهزة أولتراسونيكاتور تسمح للتحسينات في تحلل الخلايا والكروماتين القص، والقضاء على الاختلافات التي يسببها المشغل وزيادة كبيرة في استنساخه.
يصف هذا العمل بروتوكول (نظرة عامة التخطيطي في الشكل 1 ) لأداء بكفاءة رقاقة من البروتينات هيستون في خط ناضج الفأر T- دعا E2-10HA 16 ، 17 . الخلايا التائية عادة ما تكون صعبة ل ليس، وقد تم الكشف عن القص من الكروماتين لتكون غير فعالة. في هذا البروتوكول، مما يجعل من استخدام أولتراسونيكاتور تركز على التبريد، تم تحسين عدد الخلايا، العازلة تحلل، ووضع القص ل E2-10HA الماوس خط الخلايا T. يسمح هذا البروتوكول واحد لأداء رقاقة مع استنساخ عالية وفي وقت معقول. في الواقع، فإنه ريكيرإس ما يقرب من يومين لقص الكروماتين وتقييم نوعية القص، وثلاثة أيام لأداء المناعي، عكس الارتباط، وتنقية الحمض النووي.
تشيب هو تقنية صالحة للتحقيق في ما إذا كانت البروتينات أو بتمس لها إثراء في مناطق الجينومية محددة. نتائج فحص رقاقة غالبا ما تكون صعبة للتفسير لأسباب بيولوجية أو فنية. الأسباب البيولوجية كثيرة و تشمل ضعف أو غير مباشر ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي. وهناك أيضا قيود تقنية، مثل خصوصية الأجسام المضادة محدودة وتحلل الخلايا غير فعالة أو القص الكروماتين. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ( الجدول 5 ) يمكن أن تساعد القارئ على حل المشاكل التي قد تواجهها مع المقايسات رقاقة.
هذا البروتوكول، والاستفادة من جهاز أولتراسونيكاتور تركز التبريد، يسمح واحد لكفاءة القص لونين من ناضجة الماوس T- خط الخلية. وتتمثل الخطوة الحاسمة الرئيسية للبروتوكول من قبل القص من لونين، والتي يجب دائما أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. ويقترح لتغيير عدد الخلايا وعدد دورات سونيكيشن. وعلاوة على ذلك، وقالت انها أرينغ الكفاءة يتأثر سلبا وجود سدز يترسب في العينات، والتي قد تشكل خلال تحلل الخلايا على الجليد مع سدز تحلل العازلة. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاحتضان العينة بعد تحلل في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق للحد من وجود رواسب سدز. فمن المستحسن لتحسين البروتوكول للحصول على شظايا مقطوعة بين 200 و 500 نقطة في البوصة وتقييم دائما جودة القص من العينات قبل الشروع في مناعي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الأمثل الوقت التثبيت، وكمية من الأجسام المضادة و / أو الخلايا، وظروف الغسيل الأمثل لكل الأجسام المضادة.
خطوة واحدة أكثر أهمية في اتخاذ إجراء رقاقة ناجحة هو اختيار الأجسام المضادة، والأجسام المضادة منخفضة النوعية تقلل بشكل كبير من كفاءة إمونوبريسيانتاتيون. سابقا، يسمح إجراء اختبار الجودة موحدة لتقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة في السوق سس = "كريف"> 19. واستند خط أنابيب الفرز على لطخة نقطة، وصمة عار الغربية، و تشيب، وتوفير قائمة من الكواشف عالية الجودة مناسبة ل تشيب 19 . في الآونة الأخيرة، تم تقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا باستخدام عالية الكثافة هيستون الببتيد ميكروأري منصات، مما يسمح لإنشاء قاعدة بيانات حول خصوصية الأجسام المضادة 20 . يمكن للقارئ استخدام هذه الأداة المفيدة لتحديد الأجسام المضادة الأكثر تحديدا التي يمكن استخدامها لتجارب رقاقة.
لم يتم اختبار هذا البروتوكول لخلايا T الأولية، وفي هذه الحالة، يجب على القارئ الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة الأخرى التي تؤدي بنجاح رقاقة على خلايا T الأولية 3 ، 4 ، 21 . ومن الجدير بالذكر، وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لأداء رقاقة على السلف الفأر خط T- الخلية، وكذلك على خط الخلايا البطانية الماوس.
ove_content "> 5 × 10 6 خلايا ينبغي أن تستخدم لكل مناعي لتحليل علامات هيستون لأن هذا البروتوكول يمكن أيضا أن تكون مناسبة، مع بعض التحسين، لأداء رقاقة على تفس أو العوامل المساعدة، فمن الأفضل لزيادة عدد الخلايا المستخدمة في إمونوبريسيانتاتيون في هذه الحالات.من أجل الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل تجربة، يمكن تجميع أكثر أليكوتس من المحللة المقطوعة معا قبل تمييع لونين في المخزن المؤقت التخفيف.ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لأداء رقاقة على البروتينات الذاتية التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي. في هذه الحالة، قد يكون مطلوبا تثبيت مسبق مع بروسلينكرز البروتين البروتين (على سبيل المثال، ديميثيل أديبيميديت، دما) (انظر الملحق ب لمزيد من المعلومات). كان أداء ناجح من رقاقة على العوامل المساعدة سابقا من خلال أوفيركسريسينغ البروتينات التي تنصهر إلى علامة البيوتين. في هذه الحالة، تم تنقية البروتين مع ستريبتافيدين-كونجوغاتيد الخرز المغناطيسي، و قبل تثبيت مع دما تم تنفيذ 22 .
The authors have nothing to disclose.
نحن ممتنون ل P. كيس و T. شميدت-ول للمساعدة التقنية الممتازة. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة البحوث التعاونية TRR81 وبرنامج هيزنبرغ (بو 1639 / 5-1) التابع لمؤسسة البحوث الألمانية، وجمعية ماكس بلانك، و إكسك 294 في فرايبورغ، ومجموعة التميز لنظام القلب الرئوي (إكبس) في جيسن إلى مرض السل
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |