Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo basato su FACS che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico.
Abstract
Periciti sono cellule multipotenti perivascolari che mostrano eterogeneità in organi diversi o addirittura all'interno dello stesso tessuto. Nei muscoli scheletrici esistono almeno due sottopopolazioni pericite (chiamate tipo I e tipo II) che esprimono differenti marcatori molecolari e hanno differenti capacità di differenziazione. Utilizzando i topi a doppio-transgenici NG2-DsRed e Nestin-GFP, le pericelle di tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e di tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) sono state isolate con successo. Tuttavia, la disponibilità di questi topi doppi transgenici impedisce l'uso diffuso di questo metodo di purificazione. Questo lavoro descrive un protocollo alternativo che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico. Questo protocollo utilizza la tecnica di selezione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) e mira a PDGFRβ, piuttosto che a NG2, insieme al segnale Nestin-GFP. Dopo l'isolamento, digitare I e tyPe periciti mostrano morfologie distinte. Inoltre, le pericie di tipo I e tipo II isolate con questo nuovo metodo, come quelle isolate dai topi doppi transgenici, sono rispettivamente adipogenici e miogenici. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le sottopopolazioni pericite dai muscoli scheletrici e, probabilmente, da altri tessuti.
Introduction
La distrofia muscolare è un disturbo muscolare-degenerativo che non ha finora trattamenti efficaci. Lo sviluppo di terapie che promuovono la rigenerazione dei tessuti è sempre stato di grande interesse. La rigenerazione tissutale e la riparazione dopo danni dipendono da cellule staminali residui / cellule progenitrici 1 . Le cellule satellitari sono impegnate da cellule precursori myogeniche che contribuiscono alla rigenerazione muscolare 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Tuttavia, il loro utilizzo clinico è ostacolato dalla loro limitata migrazione e dal basso tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione, nonché dalla loro diminuita capacità di differenziazione dopo l'amplificazione in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Oltre ai satellitiLe cellule ei muscoli scheletrici contengono anche molte altre popolazioni cellulari con potenzialità myogenica 12 , 13 , 14 , 15 , 16 come le cellule interstiziali posizionali di fattore di crescita del recettore beta-beta (PDGFRβ) derivato dalle piastrine. Ci sono prove che dimostrano che le cellule PDGFRβ + derivate dal muscolo sono in grado di differenziarsi in cellule miogeniche e migliorare la patologia muscolare e la funzione 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ prevalentemente etichetta periciti 21 , che sono cellule perivascolari con pluripotenza 22 , 23 . Oltre al PDGFRβ, molti altri marcatori, tra cui Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, sono utilizzati anche per iDentify pericytes 21 . Va comunque osservato che nessuno di questi marcatori è specifico per cicli 21 . Recenti studi hanno rivelato due sottotipi di periciti muscolari, chiamati tipo I e tipo II, che esprimono diversi marcatori molecolari e svolgono funzioni distinte 19 , 24 , 25 . Biochimicamente, le pericelle di tipo I sono NG2 + Nestin, mentre le pericelle di tipo II sono NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funzionariamente, i periciti di tipo I possono subire differenziazione adipogenica, contribuendo all'accumulo di grassi e / o alla fibrosi, mentre i periciti di tipo II possono differenziarsi lungo il percorso miocogenico, contribuendo alla rigenerazione muscolare 19 , 24 , 25 . Questi risultati dimostrano che: (1) i periciti di tipo I possono bE destinato al trattamento di disturbi degenerativi grassi / fibrosi, e (2) le pericie di tipo II hanno un grande potenziale terapeutico per la distrofia muscolare. Ulteriori indagini e caratterizzazione di queste popolazioni richiedono un protocollo di isolamento che consente la separazione dei periciti di tipo I e tipo II ad un alto livello di purezza.
Attualmente, l'isolamento delle sottopopolazioni pericite si basa sui topi doppi transgenici NG2-DsRed e Nestin-GFP 19 , 24 . La disponibilità di topi NG2-DsRed e la qualità della maggior parte degli anticorpi NG2 limitano l'uso diffuso di questo metodo. Dato che tutti i periciti NG2 + esprimono PDGFRβ nei muscoli scheletrici 19 , 20 , 24 , ipotizziamo che NG2 può essere sostituito da PDGFRβ per l'isolamento delle periciti e delle loro subpopulazioni. Questo lavoro descrive un protocollo basato su FACS cheUtilizza la colorazione PDGFRβ e il segnale Nestin-GFP. Questo metodo è meno impegnativo per gli investigatori perché: (1) non richiede lo sfondo NG2-DsRed e (2) utilizza gli anticorpi PDGFRβ commercialmente disponibili, ben caratterizzati. Inoltre, consente l'isolamento simultaneo di periciti di tipo I e di tipo II ad alta purezza, permettendo di approfondire la biologia e il potenziale terapeutico di queste sottopopolazioni pericite. A seguito della purificazione, queste cellule possono essere coltivate in coltura e le loro morfologie possono essere visualizzate. Questo lavoro mostra anche che i periciti di tipo I e II tipo isolati utilizzando questo metodo, come quelli purificati da topi doppi transgenici, sono rispettivamente adipogenici e miogenici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periciti sono cellule perivascolari multipotenti 22 , 23 situate sulla superficie abluminale dei capillari 21 , 26 . Nei muscoli scheletrici, i periciti sono in grado di differenziarsi lungo i percorsi adipogenici e / o miogenici 19 , 20 , 24 . Recenti studi hanno rivelato due sottopopolazioni di periciti, con d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di Fund-A-Fellow della Fondazione Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) e dello Scienziato per la Sviluppo dell'American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
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