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Neuroscienze

Nouvelles méthodes pour étudier le codage désintoxiqué

Published: June 29, 2017
doi:
10.3791/55868
, , ,
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD),National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research

Summary

Nous présentons trois nouvelles méthodes pour étudier le codage gustatif . En utilisant un animal simple, la mite Manduca sexta ( Manduca ) , nous décrivons un protocole de dissection, l'utilisation de tétrones extracellulaires pour enregistrer l'activité de plusieurs neurones récepteurs gustatifs et un système pour délivrer et surveiller précisément des impulsions chronométrées.

Abstract

Le sens du goût permet aux animaux de détecter les produits chimiques dans l'environnement, donnant lieu à des comportements critiques pour la survie. Lorsque les neurones des récepteurs de déshydratation (GRN) détectent les molécules gustatives, ils encodent des informations sur l'identité et la concentration du gustateur en tant que modèles d'activité électrique qui se propagent ensuite aux neurones suiveurs du cerveau. Ces modèles constituent des représentations internes du goût, ce qui permet à l'animal de sélectionner des actions et de former des mémoires. L'utilisation de modèles animaux relativement simples a été un outil puissant pour étudier les principes fondamentaux du codage sensoriel. Ici, nous proposons trois nouvelles méthodes pour étudier le codage gustatif en utilisant la mite Manduca sexta . Tout d'abord, nous présentons une procédure de dissection pour exposer les nerfs maxillaires et la zone sous-oesophagienne (SEZ), permettant d'enregistrer l'activité des GRN à partir de leurs axones. Deuxièmement, nous décrivons l'utilisation d'électrodes extracellulaires pour enregistrer l'activité de plusieurs GRN en plaçant leTrode les fils directement dans le nerf maxillaire. Troisièmement, nous présentons un nouveau système pour la livraison et le suivi, avec une précision temporelle élevée, des impulsions de différents saveurs. Ces méthodes permettent la caractérisation des réponses neuronales in vivo directement à partir des GRN avant, pendant et après la délivrance des saveurs. Nous fournissons des exemples de traces de tension enregistrées à partir de GRN multiples et nous présentons un exemple de la façon dont une technique de tri de pointe peut être appliquée aux données pour identifier les réponses des neurones individuels. Enfin, pour valider notre approche d'enregistrement, nous comparons les enregistrements extracellulaires obtenus à partir de GRN avec des tétrones à des enregistrements intracellulaires obtenus avec des électrodes de verre pointues.

Introduction

Les systèmes gustatifs et olfactifs génèrent des représentations internes des produits chimiques dans l'environnement, ce qui donne lieu à des perceptions des goûts et des odeurs, respectivement. Ces sens chimiques sont essentiels pour susciter de nombreux comportements critiques pour la survie de l'organisme, allant de trouver des compagnons et des repas afin d'éviter les prédateurs et les toxines. Le processus commence lorsque des produits chimiques environnementaux interagissent avec des récepteurs situés dans les membranes plasmatiques des cellules réceptrices sensorielles; Ces cellules, directement ou par des interactions avec des neurones, transforment l'information sur l'identité et la concentration de produits chimiques en signaux électriques. Ces signaux sont ensuite transmis aux neurones d'ordre supérieur et à d'autres structures cérébrales. À mesure que ces étapes progressent, le signal original subit toujours des changements qui favorisent la capacité de l'organisme à détecter, discriminer, classer, comparer et stocker l'information sensorielle et sélectionner une action appropriée. Comprendre comment le soutien-gorgeTransforme l'information sur les produits chimiques environnementaux pour accomplir le mieux possible une variété de tâches est une question fondamentale en neurosciences.

On a pensé que le codage de la désintoxication était relativement simple: une vue largement répandue pose que chaque molécule chimique qui provoque un goût (un «goût») appartient naturellement à l'une des environ cinq propriétés typiques du goût (c.-à-d. Sucré, amer, aigre , Salée et umami) 1 . Dans cette vue «goût de base», le travail du système gustatif est de déterminer lequel de ces goûts de base est présent. En outre, les mécanismes neuronaux sous-jacents à la représentation de goutte de base dans le système nerveux ne sont pas clairs et sont censés être gouvernés par une "ligne marquée" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ou un "modèle de fibres" 7 </suP> , 8 code. Dans un code de ligne marqué, chaque cellule sensorielle et chacune de ses adeptes neuronales répond à une qualité de goût unique, formant ensemble un canal direct et indépendant à des centres de traitement plus élevés dans le système nerveux central dédié à ce goût. En revanche, dans un code de type fibre optique, chaque cellule sensorielle peut répondre à des qualités de goût multiples de sorte que l'information sur le goût est représentée par la réponse globale de la population des neurones sensoriels. Si l'information gustative est représentée par les goûts basiques, à travers des lignes marquées, ou par un autre mécanisme, n'est pas clair et fait l'objet de l'étude récente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nos travaux récents suggèrent que le système gustatif utilise un code de population spatiotemporel pour générerReprésentations de dégustateurs individuels plutôt que de catégories de goût basiques 10 .

Nous proposons ici 3 nouveaux outils pour faciliter l'étude du codage gustatif. Tout d'abord, nous suggérons l'utilisation du hawkmoth Manduca sexta comme un organisme modèle relativement simple susceptible d'être étudié par électrophysiologie du goût et décrire une procédure de dissection. Deuxièmement, nous suggérons l'utilisation de «tétrones» extracellulaires pour enregistrer l'activité des GRN individuels. Et troisièmement, nous proposons un nouvel appareil pour la délivrance et le suivi précis des impulsions chronométrées de l'animal. Ces outils ont été adaptés des techniques de notre laboratoire et d'autres ont utilisé pour étudier le système olfactif.

Des insectes tels que la mouche des fruits Drosophila melanogaster , la crique Schistocerca americana , ainsi que la mite Manduca sexta, ont depuis des décennies des ressources puissantes pour comprendre les principes de base sur le nerVous, y compris le codage sensoriel ( p. Ex. Olfaction 13 ). Chez les mammifères, les récepteurs du goût sont des cellules spécialisées qui communiquent avec les neurones à travers des voies complexes du second messager 1 , 14 . Il est plus simple chez les insectes: leurs récepteurs gustatifs sont des neurones. En outre, les voies de goût des mammifères près de la périphérie sont relativement complexes, présentant de multiples voies parallèles parallèles, et des composants importants sont difficiles à accéder, contenus dans de petites structures osseuses 15 . Les voies de goût des insectes semblent être plus simples. Dans les insectes, les GRN sont contenus dans des structures spécialisées connues sous le nom de sensilla, situées dans l'antenne, les embouchures, les ailes et les jambes 16 , 17 . Les GRN se projettent directement dans la zone sous-oesophagienne (SEZ), une structure dont le rôle a été jugé principalement gustatif 17 et qui contient du second ordreNeurones gustatifs 10 . De là, l'information se déplace vers le corps pour conduire des réflexes et vers des zones supérieures du cerveau pour être intégrées, stockées et, en fin de compte, pour conduire des choix comportementaux 16 .

Il est nécessaire de caractériser les réponses du goût périphérique pour comprendre comment l'information gustative se propage et se transforme de point en point dans tout le système nerveux. La méthode la plus couramment utilisée pour surveiller directement l'activité neurale des GRN dans les insectes est la technique d'enregistrement des pointes 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Cela implique de placer une électrode directement sur un sensillum, dont beaucoup sont relativement faciles d'accès. Le tastant est inclus dans l'électrode, permettant d'activer et d'extMesurer de manière racélular les réponses neuronales des GRN dans le sensillum. Mais, étant donné que le flotteur est contenu dans l'électrode, il n'est pas possible de mesurer l'activité GRN avant que le dégustateur ne soit délivré ou après qu'il soit enlevé, ou pour échanger des savons sans remplacer l'électrode 20 . Une autre méthode, la technique d'enregistrement "side-wall", a également été utilisée pour enregistrer l'activité GRN. Ici, une électrode d'enregistrement est insérée dans la base d'un sens sensum 24 , et les dégustateurs sont délivrés par un capillaire en verre séparé sur la pointe du sensillum. Les deux techniques limitent l'enregistrement des GRN à un sensillum particulier. Ici, nous suggérons une nouvelle technique: l'enregistrement à partir d'axones GRN sélectionnés au hasard de différentes sensillas, tout en délivrant séparément des séquences de dégustateurs aux proboscis. Les enregistrements Axon sont obtenus en plaçant soit des électrodes de verre pointues, soit des faisceaux d'électrode extracellulaire (tetrodes) dans le nerf qui porte les axones deGRN dans la proboscis à la SEZ 10 . Dans Manduca , ces axones traversent le nerf maxillaire, qui est connu pour être purement afférent, permettant l'enregistrement sans ambiguïté des réponses sensorielles 25 . Cette méthode d'enregistrement à partir d'axones permet, pendant plus de deux heures, une mesure stable des réponses GRN avant, pendant et après une série de présentations gustatives.

Ici, nous décrivons une procédure de dissection pour exposer les nerfs maxillaires avec la SEZ, ce qui peut permettre d'enregistrer simultanément les réponses de plusieurs GRN et des neurones dans le SEZ 10 . Nous décrivons également l'utilisation d'enregistrements extracellulaires de GRN à l'aide d'un tétractone en fil torsadé à 4 canaux sur mesure qui, lorsqu'il est combiné avec une méthode de tri de pointe, permet d'analyser simultanément plusieurs GRN (entre nos mains, jusqu'à six). Nous comparons davantage les enregistrements réalisés avec les tétrones aux enregistrements réalisés avec des cellules intracellulairesÉlectrodes. Enfin, nous décrivons un nouvel appareil pour délivrer des stimuli gustatifs. Adapté de l'équipement utilisé depuis longtemps par de nombreux chercheurs pour fournir des odeurs dans les études d'olfaction, notre nouvel appareil offre des avantages pour l'étude de la gustation: l'amélioration par rapport au système de distribution multicanaux précédent, tels que ceux développés par Stürckow et ses collègues (voir références 26 , 27 ). Contrôler la synchronisation de la livraison du flotteur tout en fournissant une lecture de la tension de cette synchronisation; Et il permet la distribution rapide et séquentielle de plusieurs stimuli tastant 10 . L'appareil baigne les proboscis dans un flux constant d'eau propre dans lequel des impulsions contrôlées de dégustateur peuvent être livrées. Chaque impulsion gustative passe au-dessus du proboscis et est ensuite lavée. Les teintures contiennent une petite quantité de colorants alimentaires insipides, permettant à un capteur de couleur de surveiller, avec un chronométrage précis, le passage du tastant ovLa proboscis.

Protocol

Attention: Des écailles fines et en poudre libérées par Manduca peuvent être allergènes, de sorte que l'utilisation de gants de sécurité en laboratoire et d'un masque facial est recommandée. 1. Dissection de Manduca sexta pour révéler les nerfs maxillaires et le SEZ Choisissez une mite appropriée de l'un ou l'autre sexe en fonction des caractéristiques suivantes: trois jours après l'éclosion avec un aspect général sain (les ailes doivent être complètement étendues, et les proboscis et les antennes doivent être intactes). Placez la mite individuellement dans une coupe en plastique pour le transport. Insérez la mite dans un tube en polypropylène. Attention: Nous recommandons d'effectuer cette étape dans une hotte pour éviter que les écailles en poudre de la mite ne se propagent. Le tube devrait être légèrement plus long que le corps de la mite ( figure 1A ). Le tube peut être fabriqué en coupant un tube en polypropylène de 15 ml. <li> Poussez la mite jusqu'à ce que la tête soit exposée et insérez un papier de soie bouclé dans l'autre extrémité du tube pour aider à garder la mite immobile ( Figure 1A ). Retirez les cheveux de la tête exposée de la mite (ventrale et dorsale) en soufflant de l'air sous pression. Un jet d'air peut être effectué en connectant une seringue (1 mL avec une aiguille, ID d'environ 1,4 mm, avec une extrémité pointue enlevée) à une source d'air comprimé. Remarque: Après avoir retiré les cheveux, toutes les étapes suivantes peuvent être effectuées à l'extérieur de la hotte aspirante. Une fois que la plupart des cheveux ont été enlevés, placez le tube dans une chambre de maintien avec la partie dorsale de la tête vers le haut, comme le montre la figure 1B . Sur une boîte à pétri, utilisez une argile de modélisation pour construire une base triangulaire d'environ 7 cm de long, 2,5 cm de haut ( Figure 1B ). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 1 : Préparation de la chambre de dissection pour Manduca . ( A ) Une mite est retenue dans un tube. La tête est exposée sur une extrémité, tandis que l'autre extrémité est branchée avec du papier de soie. ( B ) Une chambre de dissection fabriquée à partir d'une boîte de Petri et d'une argile de modélisation est représentée. La partie dorsale de la tête est orientée vers le haut. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Protégez les antennes et les proboscis. Préparez 3 petits tubes en coupant une pointe de pipette (pointes jaunes, 1-200 μL) avec une lame de rasoir en 3 pièces d'environ 0,5 cm de longueur. Le diamètre intérieur doit être suffisamment grand pour que l'antenne et les proboscis puissent s'adapter parfaitement. Préparez un crochet parPlier un fil (22 AWG, d'environ 7 cm de long). Étendre les proboscis de la mite et l'insérer dans l'un des petits tubes en le tirant avec le crochet jusqu'à ce que le tube atteigne la partie proximale de la proboscis. Fixez le petit tube avec de la cire de batik ferme (en utilisant, par exemple, un cireur électrique dentaire pour fondre et dirigez la cire) vers la partie dorsale de la capsule de tête de la mite ( Figure 2A à gauche). Placez chaque antenne dans un tube et fixez les tubes avec de la cire de batik comme le montre la figure 2A (gauche). Veillez à ne pas endommager l'antenne avec de la cire chaude. Stabiliser le cerveau contre le mouvement en coupant les muscles qui recouvrent la face antérieure du cerveau ( c'est-à-dire le muscle compresseur buccal). Sous le microscope à dissection, utilisez des ciseaux à micro-dissection ou un mini-axe fabriqué à partir d'une puce de rasage collée à un cure-dent pour ouvrir la capsule de tête par makUne petite coupe juste en dessous de la proboscis ( figure 2A , insertion supérieure gauche). Utilisez des ciseaux à micro-dissection pour couper le muscle du compresse buccal (pour les illustrations, voir la référence 25 ). Comme le muscle n'est pas facilement visible, le test de comportement suivant est recommandé pour confirmer qu'il a été coupé. Diluer le saccharose dans de l'eau distillée pour obtenir une solution de 1 M. Utilisez une pipette pour délivrer environ 200 μl de solution de saccharose aux 2/3 distal des proboscis et observez les proboscis pendant 5 min. Si le muscle a bien été coupé, l'insecte ne devrait pas pouvoir prolonger ou déplacer le proboscis. Appliquer une couche de cire de batik fondu pour sceller l'ouverture dans la capsule de tête. Retournez l'insecte afin que le côté ventral de la capsule de tête soit maintenant tourné vers le haut. Pour perfusion de solution saline pendant et après la procédure de dissection, construire une tasse de cire autour du côté ventral de la tête usinG le cireur électrique: sous un microscope à dissection, commencez à construire la tasse en appliquant la première rangée de cire le long de l'avant de la tête, en direction de l'arrière. Gardez les tubes de proboscis et d'antennes à l'intérieur de la coupe ( Figure 2A à droite). Continuez à construire la tasse vers l'extérieur et vers le haut jusqu'à ce qu'elle atteigne le niveau des yeux. Utilisez une pince pour prendre l'un des deux palets labiaux, puis placez-le sur le côté et fixez-le dans la vasque en ajoutant plus de cire fondue. Faites de même avec l'autre palpage maxillaire ( Figure 2A à droite). Sceller les ouvertures dans la cire et les tubes. Remarque: Dans cette étape, l'époxy est utilisé car il permet de sceller facilement les trous dans la cire et les tubes, et évite tout dommage causé par la chaleur aux antennes et aux proboscis. Utilisez un cure-dent pour mélanger l'époxy binaire dans un plat de mélange en plastique. Conserver le plat de mélange. Utilisez le cure-dents pour appliquer une minceCouche d'époxy à l'extérieur et à l'intérieur de la coupe ( figure 2B ). Remplissez l'espace vide dans les tubes qui contiennent le proboscis et les antennes avec de l'époxy, et remplissez la partie du tube en polypropylène entourant le cou avec suffisamment d'époxy pour le maintenir fermement en place ( Figure 2B ). Laissez l'époxy sécher pendant environ 20 min. Pour vérifier cela, testez l'époxy restant dans le plat de mélange en plastique pour s'assurer qu'il est solide et qui ne colle plus. Remplir le gobelet de cire avec la solution salée physiologique Manduca 28 et attendre quelques minutes pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fuites. Si une fuite est visible, essayez de la sceller en appliquant plus de cire chaude et / ou d'époxy. Figure 2 : Préparation de Manduca </Em> pour Dissection. ( A ) Les antennes et les proboscis sont protégés à l'intérieur de petits tubes fabriqués à partir de pointes de pipettes coupées en trois pièces d'environ 0,5 cm de longueur. (Panneau gauche, grande image) Les tubes sont solidaires de la cire de batik fondue appliquée autour de la partie dorsale de la tête. (Panneau gauche, insertion) Pour enlever le muscle du compresse buccal, le côté dorsal de la capsule de tête est ouvert en faisant une petite coupe comme indiqué par la ligne pointillée dans la grande image. (Panneau droit) Une tasse de cire est construite autour du côté ventral de la tête comme réservoir de solution salée perfusée lors de la procédure de dissection et des expériences d'enregistrement. ( B ) Epoxy est utilisé pour sceller les interstices entre la base de la vasque de cire et la partie dorsale de la tête (panneau de gauche) et entre la cire et les tubes contenant les antennes et les proboscis, y compris les ouvertures des tubes (panneau droit ). Cliquez ici tO voir une version plus grande de ce chiffre. Sous le microscope à dissection, utilisez des ciseaux à micro-dissection pour couper les palps labiaux. Utilisez des ciseaux à micro-dissection ou une mini-hache pour ouvrir le côté ventral de la capsule de tête en faisant quatre coupes: deux coupes le long de la cuticule qui entoure chaque œil du dos à l'avant, une coupe sur la cuticule le long du dos de la tête, Et on coupe la cuticule le long de l'avant de la tête près de la proboscis ( figure 3A ). Retirez délicatement la cuticule à l'aide d'une pince à micro-dissection pour exposer le cerveau. En utilisant deux pince à micro-dissection aiguë, retirez lentement et soigneusement le tissu adipeux et la trachée couvrant le SEZ. Évitez tout dommage au cerveau ou aux nerfs (p. Ex., Nerf maxillaire, nerf optique, connecteur cervical). Rincez le cerveau en remplaçant fréquemment la solution saline et ajustez la lumière souvent pour une meilleure visibilité. Note: Ceci peut être la partie la plus critique du diSsection; Il est facile d'endommager par inadvertance le nerf maxillaire en le tirant ou en l'écrasant. Note: À ce stade, la SEZ et les nerfs maxillaires doivent être clairement visibles ( figure 3B- 3C ). Cependant, le cerveau et les nerfs maxillaires sont couverts par une fine gaine. Pour enlever la gaine, remplacez la solution saline dans le gobelet de cire avec une collagénase à 10% (p / v) dissoute dans une solution saline et laissez-la en place pendant 5 min. Ensuite, après avoir rincé le cerveau plusieurs fois avec de la solution saline, retirez doucement la gaine avec une pince à microdésection super fine en tirant la gaine de la SEZ à travers les nerfs maxillaires. Commencer à perfuser le gobelet de cire avec une solution salée fraîche. Placez le tube à partir d'une goutte à goutte salée dans la vasque à cire et fixez-la avec de la cire fondue. figueUre 3 : Manduca Dissection Procedure. ( A ) Le palais labial enlevé, la capsule de tête est ouverte en faisant quatre coupes comme indiqué par la ligne pointillée. ( B ) Une image agrandie du cerveau après avoir ouvert la capsule de la tête et l'élimination du tissu adipeux et de la trachée, permettant la visualisation des nerfs maxillaires (MxN) et de la zone sous-oesophagienne (SEZ, terme correspondant à la zone du cerveau sous la œsophage). Les nerfs maxillaires portent des axones des neurones récepteurs gustatifs (GRN) dans les proboscis à la SEZ. ( C ) Un schéma d'un cerveau Manduca . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 2. Système de livraison Tastant Le système de distribution est composé de quatre éléments principaux: la source d'eau, le collecteur de goût, le capteur de couleur et le site contenant leProboscis, tous connectés à un tube en plastique rigide ( Figure 4A -4B ). Pour construire ce système, procédez comme suit: Figure 4B . Utilisez un tube en plastique rigide d'environ 6 cm de longueur (ID 0,3 cm). Utilisez un fer à souder pour faire un petit trou dans le tube où le proboscis va être placé ( Figure 4A -4B ). Pour s'assurer que les proboscences de différents animaux sont toujours placées au même endroit, attachez du matériel de tamisage en plastique (maillage, diamètre d' ouverture d'environ 0,1 cm) dans le tube ( Figure 4A -4B ). Avec une lame de rasoir ou un outil rotatif, couper le tube rigide à environ 5 mm au-dessus du trou de proboscis. Placez le maillage entre les deux morceaux de tube. Fixez le maillage et reconnectez les tubes en appliquant de l'époxy à l'extérieur des tubes. Laissez l'époxy sécher pendant environ 20 min. Pour une livraison gustative, utilisez une machine pressuriséeSystème de perfusion avec autant de tubes gustatifs que nécessaire, joint à un collecteur (voir ci-dessous). Utilisez le fer à souder pour former un petit trou dans le tube rigide à environ 1 cm au-dessus du maillage. Insérez le tube de sortie du système de perfusion (ID 0,86 mm) dans le tube rigide et fixez-le par application d'époxy ( Figure 4A -4B ). Utilisez une pompe péristaltique pour fournir un débit constant (~ 40 mL / min) d'eau distillée. Connectez-le avec un tube en silicone au tube rigide ( Figure 4A- 4C ). Connectez l'autre côté du tube rigide à un autre tube de silicium pour diriger la sortie vers un grand conteneur de déchets ( Figure 4A -4C ). Pour distribuer le goût, injecter de l'air comprimé dans le collecteur du système de perfusion. Ceci peut être réalisé, par exemple, en utilisant une pompe pneumatique (10 psi) commandée par une entrée d'impulsion de tension temporisée pour injecter de l'air comprimé dans le manifol D tube contenant le goût désiré. Une impulsion de 1s éjecte environ 0,5 ml de saveur. 3. Préparation et surveillance du dégustation Diluez le goût de l'eau distillée à la concentration désirée. Soyez conscient que le flotteur sera encore dilué par le courant d'eau. Nous avons mesuré la concentration finale atteignant le proboscis comme 77% de la concentration initiale (voir les références 10 , 29 ). Ajouter un colorant alimentaire artificiel à chaque solution gustative pour permettre de déterminer le moment précis avec lequel le flotteur passe sur les proboscis. Nous avons constaté que le colorant vert (voir la liste des matériaux ) à 0,05% p / v n'active pas les GRAN Manduca . Utilisez un capteur de couleur (voir le tableau 1) pour détecter la coloration alimentaire dans les solutions de goût. Utilisez un fer à souder pour former un trou adjacent à la maille et à 0,5 cm sous le tube de sortie du système de perfusion ( S = "xfig"> Figure 4A -4B). Branchez le capteur sur le tube rigide et fixez-le en appliquant de l'époxy à l'extérieur. Enregistrez la sortie de tension du capteur de couleur en tant que signal analogique avec des signaux physiologiques (voir la section 4). Le signal de tension du capteur de couleur peut être amplifié à l'aide d'un amplificateur à courant continu connecté au capteur ( Figure 4A ). Assurez-vous que le capteur de couleur fonctionne en fournissant le goût et en enregistrant la sortie de tension du capteur. Le signal provoqué par le colorant devrait dépasser le niveau de bruit. Réglez le débit d'eau constant pour que le signal soit le plus proche possible du carré. Remarque: Lors de la livraison de plusieurs dégustateurs en séquence, notez que le premier essai avec un nouveau flotteur consistera en un mélange du nouveau dégustateur précédent et précédent. Pour cette raison, nous n'avons pas analysé ces premiers essais. "> Figure 4 : Système de livraison Tastant. ( A ) Un schéma de l'appareil utilisé pour délivrer et surveiller les impulsions chronométrées de flotteurs aux proboscis de l'animal. Les principaux composants du système sont désignés par des nombres rouges. Un flux constant d'eau distillée est maintenu à travers les proboscis par une pompe péristaltique reliée à un tube en silicone au tube de plastique rigide (1) où doit être placé le proboscis (6). Les produits contenant une petite quantité de colorant sans goût sont délivrés à l'aide d'un système de perfusion pressurisé à 16 canaux. Les réservoirs contenant les dégustateurs sont reliés à un collecteur (2) qui est fixé au tube rigide, au-dessus du trou où le test doit être placé (5). L'air comprimé d'une pompe pneumatique est injecté dans le système de perfusion pour délivrer rapidement un goût, avec un chronométrage contrôlé par un logiciel personnalisé. UNELe capteur de couleur (3) est utilisé pour surveiller la livraison de goût. Le capteur est connecté au tube rigide adjacent à la proboscis et au-dessous de la sortie du système de perfusion de goût. Le signal de tension du capteur de couleur est amplifié par un amplificateur à courant continu. La trace rouge sur l'insertion adjacente à l'amplificateur illustre un signal de couleur enregistré à l'aide d'un logiciel personnalisé d'acquisition de données; L'augmentation et la diminution rapides du signal reflètent l'arrivée et le lavage du gustatif, respectivement. Les proboscis de la mite sont placés dans un trou (5) situé juste en dessous du capteur de couleur. Un maillage (4) est placé au-dessus du trou pour s'assurer que les proboscences de différents animaux sont toujours positionnées au même endroit. L'autre côté du tube rigide est relié à un autre tube de silicium pour diriger la sortie vers un conteneur de déchets (7). ( B ) Image montrant les principaux éléments du système de distribution de tastant connecté au tube de plastique rigide, qui sont indiqués par les nombres rouges comme indiqué dans le panneau A: l'eauLa source (6), le tube de sortie du collecteur de flotteur (2), le capteur de couleur (3), le maillage (4) et le trou où le proboscis doit être inséré (5) tous connectés dans un tube de plastique rigide (1) . ( C ) Le placement de la préparation Manduca dans la configuration est affiché. Les distal t2 / 3 des proboscis de la mite sont introduits dans le trou (5) au tube de plastique rigide (1). La proboscis est sécurisée en place avec de la cire dentaire et de l'époxy comme indiqué par l'encart. L'entrée d'eau du tube rigide et sa sortie vers un conteneur de déchets sont indiquées respectivement par les nombres 6 et 7. Le numéro 2 indique le tube de sortie du collecteur de flotteur. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 4. Enregistrement de tétrade extracellulaire pour surveiller l'activité évoquée par les tastes dans les GRN Placez la préparation de mites sur une plate-forme sous un stéréomicroscope sur un vibrTableau isolant ( Figure 4C ). Mettez les deux tiers distal des proboscis de la mite dans le tube rigide du système d'administration de goût ( Figure 2B ). Pour ce faire, prolonger les proboscis de la mite, puis insérez-la dans le trou du tube rigide en la poussant doucement avec l'aide de pince à pansement. Sceller les proboscis en place avec de la cire dentaire douce puis une couche d'époxy pour éviter les fuites ( Figure 4C , entrée). Connectez la ligne de perfusion saline à la capsule de la tête et réglez le débit de perfusion à un taux constant d'environ 0,04 L / h. Immerger une électrode de masse ( c.-à – d. Un fil d'argent chloré) dans le bain salin ( Figure 5A ). Utilisez un tetrode en fil torsadé fabriqué à la main construit suivant la procédure de fabrication décrite en 30 (4 fils d'électrode sont suggérés pour obtenir des unités bien isolées et pour s'adapter àle nerf). Avant l'expérience, électrodez l'électrode en suivant les étapes décrites en 30 . Utilisez un micromanipulateur manuel pour positionner le tétrone près du nerf maxillaire. Avancez la tétrone jusqu'à ce qu'elle commence à entrer dans le nerf ( Figure 5 ). Attendez au moins 10 minutes après avoir placé le tétrame pour lui permettre de se stabiliser dans le nerf avant l'enregistrement. Amplifiez le signal (3000x) et utilisez un filtre passe-bande réglé entre 0.3-6 kHz. Acquérir le signal à un taux d'échantillonnage de 40 kHz en utilisant un logiciel d'acquisition de données. Après avoir terminé, l'expérience place la préparation de la pyrale dans le congélateur. Figure 5 : enregistrement de Tetrode à partir de GRN. ( A , grande image) Un micromanipulateur est utilisé pour pDentelez le tétroupe torsadé dans le nerf maxillaire (MxN) pour enregistrer l'activité des GRN. Une électrode de terre argentée au chlorure est placée dans le bain salin comme indiqué. ( A , insertion) Une image agrandie du cerveau montrant le tétrone dans le nerf maxillaire. La zone sous-oesophagienne (SEZ) est également indiquée. ( B ) Un schéma d'un cerveau Manduca orienté comme en A. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Representative Results

L'activité des GRN peut être enregistrée à l'aide d'une électrode de tétractone extracellulaire avant, pendant et après la distribution du goût ( Figure 6A et 6C ). La figure 6A (panneaux moyens et inférieurs) montre des traces de tension filtrées (300 à 6 000 Hz) enregistrées par chacun des quatre fils placés dans le nerf maxillaire, où des signaux de différentes amplitudes reflétant des potentiels d'action (flèches) peuvent être observés. Une impulsion de tastant de 1 s (saccharose 1 M) a été délivrée 2 s après le début de l'expérience; L'apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur ( Figure 6A , panneau supérieur). Les pointes induites par le gustatif peuvent être observées dans chacun des quatre canaux ( figure 6A , panneau central). Les GRN peuvent être identifiés et distingués des mécanosensors (aucun montré ici) quand ils répondent à des dégustateurs et pas à d'autres <sup class = "xref"> 10. Pour identifier et isoler les réponses des neurones individuels à partir des enregistrements de tetrode, nous avons effectué un triage hors ligne en utilisant un ensemble de fonctions personnalisées basées sur les 32 , 33 méthodes de Pouzat et Kleinfeld (ces méthodes sont décrites dans ces citations: 10 , 29 ). La figure 6B montre un exemple de tri des pointes appliqué aux données représentées sur la figure 6A , dans lesquelles trois unités bien isolées ont été trouvées. Les tracés de la Figure 6C représentent les réponses des trois unités isolées de la Figure 6B à six dégustateurs différents (1 M de saccharose, maltose et NaCl, 100 mM de caféine et 10 mM de berbérine et lobeline) livrés en séquence (4 essaisS / tastant sont affichés). Comme le montre la figure 6C , les GRN enregistrés ont différents niveaux d'activité de base, allant du silencieux (GRN 1) à faible ou modéré (GRN 2 et 3). Après l'apparition des tastants, les GRN présentent divers modèles d'activité et affichent une sélectivité différente des dégustateurs. Par exemple, le GRN 1 a répondu uniquement au saccharose, alors que le GRN 2 a répondu au maltose et à la NaCl avec un éclat de pointes et à la lobeline avec un pictement uniquement au début du stimulus. En outre, certaines réponses sont verrouillées au moment du stimulus ( p. Ex. Réponse au GRN 1 au saccharose), tandis que d'autres réponses dépassent la durée du stimulus ( p. Ex. Réponse au GRN 3 à la berbérine) ou contiennent à la fois des composants excitateurs et inhibiteurs ( p . Ex. Figure 7 Les réponses du GRN 2 au NaCl et au saccharose). Pour plus d'informations sur les diverses sensibilités et les profils d'activité des GRN, voir la référence 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= "1"> Pour valider l'utilisation des techniques de tetrode et de tri de pointe pour enregistrer les GRN du nerf maxillaire, nous avons effectué des enregistrements intracellulaires à partir d'axones GRN dans d'autres animaux en utilisant des électrodes de verre pointu classiques (résistance de 80-120 MΩ). Nous avons constaté que les modèles d'activité obtenus en utilisant des enregistrements intracellulaires étaient semblables aux réponses observées en utilisant la technique de la tétrade ( figure 7 ). Les traces de tension dans la boîte verte dans le panneau A ont été enregistrées intracellulairement à partir de GRN 1 au cours de 5 essais consécutifs de présentation de saccharose, et les mêmes réponses sont présentées sous forme de diagrammes raster dans le panneau B. (Notez que ce type de réponse correspond à celui obtenu avec les tétrones et Montré à la figure 6C .) Le GRN 2, enregistré avec des électrodes intracellulaires pointues, présente un modèle de réponse plus large. <img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/> Figure 6: Résultats représentatifs des enregistrements du nerf maxillaire avec des tétractones extracellulaires. ( A ) Les traces de tension filtrées (300 à 6 000 Hz) enregistrées par chacun des quatre fils au niveau du nerf maxillaire sont indiquées (panneau central). Une impulsion de tastère de 1 s a été appliquée pendant la période indiquée par l'ombrage rouge dans le panneau central. L'apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur comme indiqué par la trace de tension rouge sur le panneau supérieur, et est indiqué sur le panneau central par la zone ombrée rouge. Les lignes horizontales pointillées représentent +50 (haut), 0 (milieu) et -50 (en bas) μV. Un élargissement des traces de tension brut correspondant à la zone à l'intérieur des lignes pointillées verticales est affiché (panneau inférieur). Des exemples de pointes sont indiqués par les flèches. ( B ) Un exemple de tri des pointes appliqué aux données présentées dans le panneau A. Les formes d'onde enregistrées à chacun des quatre fils extracellulaires (1-4) sontE identifié avec trois GRN différents (unités 1-3) contribuant aux signaux enregistrés. Les événements individuels (lignes fines colorées) et la moyenne (ligne noire épaisse) sont représentés pour les trois unités. Un certain nombre de critères statistiques doivent être considérés pour identifier de manière fiable les unités indépendantes à l'aide de la méthode de tri des pointes (voir les références 10 , 29 ). ( C ) Les parcelles raster représentant les réponses des trois unités isolées à une séquence de six dégustateurs différents (4 essais / dégustateur sont présentés). La période de livraison du flotteur (1 s) est indiquée par la zone ombrée rouge. Les concentrations de flotteurs étaient soit 1 M (saccharose, maltose, NaCl), 100 mM (caféine) et 10 mM (berbérine et lobeline). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <img alt="Figure 7" c lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" /> Figure 7 : Enregistrements intracellulaires des axones du GRN. ( A , panneau de la boîte verte) Les traces de tension enregistrées à partir d'un GRN avec des électrodes intracellulaires à verre pointu (résistance de 80 à 120 MΩ) placées dans le nerf maxillaire, provoquées par 5 stimulations consécutives avec 1 M de saccharose (Suc). ( B ) Les tracés des réponses de deux GRN, y compris les réponses présentées dans le panneau A (panneau de la boîte verte), à ​​deux dégustateurs différents livrés en séquence (couleur de police grise 100 mM, 1 couleur de police noir) enregistrée avec des électrodes intracellulaires à verre pointu Placé dans le nerf maxillaire (7 essais / dégustateur et 3 essais / eau sont présentés). Le temps de livraison du tastant est indiqué par des zones ombrées rouges dans les deux panneaux. L'apparition et le décalage de la stimulation ont été surveillés par le capteur de couleur, comme indiqué par les traces de tension rouge au bas de chaque panneau.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les méthodes décrites ici permettent des enregistrements in vivo d'un animal relativement simple, Manduca sexta , pour caractériser l'activité de multiples GRN sélectionnés au hasard pendant de longues durées (pendant plus de 2 h), avant, pendant et après l'administration du goût. Ces méthodes permettent également la distribution rapide et séquentielle de stimuli tastant multiple avec un contrôle temporel précis, des avantages utiles pour l'étude des mécanismes neuronaux sous-jacents à la représentation gustative. Ce protocole a été utilisé pour étudier comment les réponses des GRN aux saveurs sont transformées lorsqu'elles sont transmises à leurs neurones cibles post-synaptiques ( p. Ex. Dans la SEZ) en surveillant les GRN simultanément avec des interneurones connectées monosynaptiquement 10 . En outre, ces méthodes peuvent être adaptées aux besoins de l'expérimentateur, permettant l'exécution de paradigmes complexes pour étudier les aspects fondamentaux du codage gustatif.

Quand commenceNos études, un problème technique auquel nous avons parfois eu à résoudre était l'incapacité de détecter les signaux de pointe du nerf maxillaire avec les fils de tétrode. Les causes possibles de cela sont diverses, car le protocole de dissection est difficile et certaines pratiques sont nécessaires pour obtenir une bonne préparation. Tout d'abord, lors de la dissection de la mite, les nerfs maxillaires sont faciles à endommager, en particulier lors de l'élimination de la gaine entourant le tissu nerveux. Deuxièmement, si la gaine n'est pas complètement enlevée, les fils de tétrode peuvent ne pas pouvoir accéder au nerf. Dans les deux cas, le démarrage d'une nouvelle préparation est souvent le moyen le plus simple de résoudre ces problèmes. Troisièmement, il peut y avoir un problème avec les fils de tétrame. Cela peut être vérifié en mesurant l'impédance des fils qui devrait être de ~ 270 kΩ à 1 kHz. Si la valeur d'impédance est supérieure à ~ 300 kΩ, électrodez les fils avec de l'or pour obtenir l'impédance souhaitée (voir référence 30 ). Quatrièmement, un équipement peut être mal connectéOu mal à l'aise.

Un autre problème possible est que les signaux d'attaque sont enregistrés, mais le (s) neurone (s) semblent ne pas répondre aux saveurs. Cela pourrait être dû au fait que les neurones enregistrés sont insensibles à l'ensemble des dégustateurs livrés. En outre, il est important de garder à l'esprit qu'en plus des axones de GRN, le nerf maxillaire porte également des fibres mécanosensorielles. Ainsi, il est possible d'enregistrer à partir de neurones mécanosensoriels au lieu de, ou en plus, de GRN. Cependant, le système de distribution de tampons est conçu pour fournir une entrée mécanique constante tout au long de l'expérience, rendant improbable que les réponses à un goût soient confondues par des réponses au composant mécanique de sa livraison. Les neurones qui répondent à certains dégustateurs, mais pas à d'autres, à des dégustateurs différents, peuvent être classés sans ambiguïté en tant que GRN. Nous recommandons d'utiliser des savoureux fraîchement dilués pour éviter les variations de concentration ou de composition du goût en raison de la dégradation ou de l'évaporation des composésDu solvant. Nous recommandons également de nettoyer le système régulièrement afin d'éviter toute contamination et / ou obstruction des tubes.

Un autre problème technique possible est un rapport signal / bruit désavantageux. Ce problème peut souvent être résolu en rechargeant ou en ajustant la position de l'électrode de sol du bain. D'autres solutions peuvent nécessiter un blindage et minimiser la longueur de chaque connexion électrique dans l'appareil.

Enfin, il est important de noter que l'analyse correcte des données obtenues à l'aide d'enregistrements de tétrone requiert un tri précis des pointes. Nous avons constaté que les méthodes entièrement automatisées sont généralement inadéquates. Nous recommandons de se familiariser avec la littérature de tri de pointes avant d'analyser les données de tétrée 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .

Alternatives à notre dissection proTocol peut être utilisé. Ici, nous avons décrit une dissection à travers la partie ventrale de la tête de mite, donnant accès aux nerfs maxillaires et SEZ, mais il est également possible d'accéder à ces structures en disséquant à travers le côté dorsal. Nous avons constaté que la préparation du côté dorsal n'est pas optimale pour faire des enregistrements de ces structures gustatives en raison de leur emplacement profond, mais cette préparation offre l'avantage de permettre des enregistrements à partir de structures d'ordre supérieur telles que le corps de champignon, une zone qui a été associée à plusieurs Intégration sensorielle, apprentissage associatif et traitement de la mémoire 34 . Nous nous sommes concentrés sur l'utilisation d'électrodes de tétrame pour enregistrer à partir du nerf maxillaire, mais, comme nous l'avons illustré, des électrodes classiques intracellulaires peuvent également être utilisées à cette fin. En outre, les deux techniques peuvent être combinées pour effectuer des enregistrements simultanés à partir de plusieurs domaines du cerveau 10 . La littérature sur les neurosciences offre de nombreux exemples de iLes modèles nvertébrés qui se sont révélés être des outils puissants pour révéler les principes fondamentaux du traitement sensoriel, tels que le codage olfactif, qui s'appliquent à la fois aux insectes et aux vertébrés 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Nous espérons que nos méthodes conduiront à de nouvelles idées fondamentales sur le codage gustatif.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention intramuros du NIH-NICHD à MS. Nous remercions G. Dold et T. Talbot du NIH-NIMH Instrumentation Core Facility pour l'aide à la conception du système de livraison de tastant.

Materials

Dissection and specimen preparation
Polypropylene tube, 15 ml -Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2"   MONOJET 888200144 For aplying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish-100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1-200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervious tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline perfusion system
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant delivery system
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421  Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
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Riferimenti

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Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding. J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).
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