Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Die Abbildung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatin-Remodelern und anderen chromatin-assoziierten regulatorischen Faktoren ist der Schlüssel zum Verständnis aller chromatinbasierten Prozesse. Während Chromatin-Immunpräzipitation und High-Throughput-Sequenzierung (ChIP-seq) Ansätze verwendet wurden, um viele wichtige Einblicke in die Genom-Biologie zu gewinnen, haben sie bemerkenswerte Einschränkungen. Wir haben vor kurzem eine alternative Methode eingeführt, die als Chromatin-endogene Spaltung und High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) ¹ bezeichnet wird, um diese Nachteile zu umgehen.

ChIP-seq wird am häufigsten mit einem anfänglichen Formaldehyd-Vernetzungsschritt (X-ChIP-seq) durchgeführt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten. Eine Reihe neuerer Studien haben jedoch gezeigt, dass X-ChIP-seq transiente oder unspezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen ^{2 , 3 , 4 , 5} <einfängtSup>, ^{6 , 7 , 8} , was zu falsch-positiven Bindungsstellen führt. Darüber hinaus schützt die Beschallung, die gewöhnlich verwendet wird, um Chromatin in X-ChIP-seq-Experimenten zu zersplittern, vorzugsweise Regionen von offenem Chromatin, was zu einer voreingenommenen Rückgewinnung von Fragmenten aus diesen Regionen ^{9 , 10 führt} . Sonate liefert auch eine heterogene Mischung von Fragmentlängen, die letztlich die Bindungsstellenauflösung begrenzt, obwohl die Zugabe eines Exonuklease-Verdauungsschrittes die Auflösung ^{11 , 12} stark verbessern ^kann . Native ChIP-Verfahren wie besetzte Regionen von Genomen aus affinitätsgereinigtem natürlich isoliertem Chromatin (ORGANIC) ¹³ verwenden keine Vernetzung und Fragmentchromatin mit Mikrokokken-Nuklease (MNase), wodurch die mit der Formaldehydvernetzung und der Ultraschallbehandlung verbundenen potentiellen Biasen vermieden werden. Aber,Die Löslichkeit vieler chromatingebundener Proteine ​​unter den relativ milden Bedingungen, die für die native Chromatinextraktion erforderlich sind, ist schlecht, was möglicherweise zu einem verminderten Dynamikbereich und / oder falschen Negativen führt ¹⁴ .

Während verschiedene Iterationen von ChIP-seq am häufigsten für die genomweite Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet werden, wurden auch mehrere Mapping-Techniken, die auf der Fusion von Proteinen interessiert sind, die für verschiedene DNA-modifizierende Enzyme von Interesse sind, implementiert. Ein solcher Ansatz ist die DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung (DamID) ¹⁵ , wobei ein interessantes chromatinbindendes Protein genetisch an Dam verdünnt ist und diese Fusion in Zellen oder Tieren exprimiert wird, was zu einer Methylierung von GATC-Sequenzen proximal zu Bindungsstellen für das Protein führt. DamID ist insofern vorteilhaft, als sie sich nicht auf Immunpräzipitation beruft und so Vernetzungsmittel, Antikörper oder Chromatin-Solubilisierung vermeidet. Es wird auch in vivo durchgeführt. aberIst die Auflösung von DamID auf die Kilobase-Skala beschränkt und die Methylierungsaktivität des Dam-Fusionsproteins ist konstitutiv. Eine zweite Methode, die auf einer enzymatischen Fusion basiert, ist die Calling Card-Seq ¹⁶ , die eine Fusion von einem Faktor von Interesse für eine Transposase einsetzt und die ortsspezifische Integration von Transposonen leitet. Wie DamID, Calling Card-Seq ist nicht auf Immunpräzipitation basiert und hat somit ähnliche Vorteile, mit dem zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Auflösung. Jedoch kann Calling Card-seq durch Sequenzvorspannungen von Transposasen begrenzt werden und ist auch auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen in der Nähe von Transposon-Insertionsstellen angewiesen.

Eine dritte enzymatische Fusionsmethode, die im Laemmli-Labor entwickelt wurde, ist die Chromatin-endogene Spaltung (ChEC) ¹⁷ . In ChEC wird eine Fusion zwischen einem Chromatin-assoziierten Protein und MNase in Zellen exprimiert, und bei der Calciumzugabe zur Aktivierung von MNase wird die DNA proximal zu den Bindungsstellen für die markierten markiertFaktor ( Abbildung 1 ). In Verbindung mit dem Southern-Blotting wurde ChEC verwendet, um die Chromatinstruktur und die Proteinbindung an einer Anzahl von einzelnen Loci in Hefe ^{17 , 18} zu charakterisieren, und wurde mit einer niederauflösenden Mikroarrayanalyse kombiniert, um die Wechselwirkung von Kernporenkomponenten mit der Hefe zu untersuchen Genom ¹⁹ ChEC bietet Vorteile wie DamID und Calling Card-seq, und seine Auflösung ist fast ein-Basis-Paar, wenn durch die Primer-Erweiterung ¹⁹ analysiert. ChEC ist auch kontrollierbar: Die robuste DNA-Spaltung durch MNase hängt von der Zugabe von millimolarem Calcium ab, wobei sichergestellt wird, dass MNase bei den niedrigen freien Calciumkonzentrationen, die in lebenden Hefezellen beobachtet werden, inaktiv ist.

Bisher haben wir postuliert, dass die Kombination von ChEC mit High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) hochauflösende Karten von TF-Bindungsstellen bereitstellen würde. In der Tat, ChEC-seq erzeugte hochauflösende Karten der angehenden Hefe allgemeine regulatorische Faktoren (GRFs) Abf1, Rap1 und Reb1 über das Genom ¹ . Wir haben auch ChEC-seq auf den modularen Mediator-Komplex angewendet, einen konservierten, essentiellen globalen Transkriptions-Coaktivator ²¹ , der die Anwendbarkeit von ChEC-seq auf Megadalton-Komplexe erweitert, die nicht direkt mit DNA in Berührung kommen und durch ChIP- Basierte Methoden. ChEC-seq ist eine leistungsstarke Methode sowohl für die unabhängige Validierung von ChIP-seq-Ergebnissen als auch für die Erstellung neuer Einblicke in die Regulierung von Chromatin-residenten Prozessen. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Umsetzung dieser Methode in knospende Hefe vor.