Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen
Summary
Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.
Abstract
In deze studie beschrijven we een afgekorte-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen. De Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) lost effectief native gevouwen eiwitten in hersenweefsel waardoor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten uit een breed scala van neurodegeneratieve proteinopathies, zoals De ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson en Amyotrofische laterale sclerose en prionziekten. Menselijke controle en AD postmortem hersenen weefsels waren gehomogeniseerde en gesedimenteerd door ultracentrifugatie in aanwezigheid van sarkosyl te verrijken wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten met inbegrip van pathologische gefosforyleerd tau, de belangrijkste component van neurofibrillary klitten in AD. Westelijke bevlekken aangetoond de differentiële oplosbaarheid van geaggregeerde phosphorylated-tau en het wasmiddel-oplosbaar eiwit, vroege Endosome antigeen 1 (EEA1) in controle en AD hersenen. Proteoom analyse bleek ook verrijking van β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 – 70 K), en apolipoproteïne E (beleidsverklaring) in de sarkosyl onoplosbare breuken van AD hersenen vergeleken met die van de controle, consistent met de vorige weefsel fractionering strategieën . Dit eenvoudige verrijking protocol is dus ideaal voor een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van westelijke bevlekken en functionele eiwit co aggregatie testen tot massa spectrometrie gebaseerde proteomics.
Introduction
Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de nauw verwante prionziekten worden gekenmerkt door de geleidelijke accumulatie van proteinopathies wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten in de hersenen met bijbehorende cognitieve achteruitgang. 1 , 2 deze gedeelde pathologische functie wordt beschouwd als een centrale rol in de etiologie en pathofysiologie van deze neurodegeneratieve ziekten. 2 deze aggregaten bestaan meestal uit polymere amyloïde vezels, die zijn samengesteld uit herhalende eenheden van het misfolded eiwit tentoonstellen Kruis β-structuur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemically, amyloïde aggregaten zijn zeer resistent tegen chemische of thermische denaturatie- en solubilisatie,3 , waarin een unieke uitdagingen voor hun zuivering, analyse en studie via traditionele biochemische technieken. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 is niet verwonderlijk dat het wasmiddel onoplosbare eiwitoplossing is de focus van veel onderzoek naar de pathofysiologie van neurodegeneratieve ziekten waarbij de accumulatie van misfolded eiwitten. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische fractionering technieken hebben vaak gebruikt om te verrijken het wasmiddel onoplosbare breuk van postmortem hersenen homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 een van de meest voorkomende methoden omvat de sequentiële winning van weefsel homogenates met buffers en detergentia starheid, gevolgd door ultracentrifugatie te partitioneren van de oplosbare en onoplosbare breuken te verhogen. Een veelgebruikte sequentiële fractionering protocol6,14 houdt de homogenisering van de bevroren weefselmonsters in een wasmiddel-vrije zoutarm (LS)-buffer en de resulterende onoplosbare pellets zijn dan sequentieel geëxtraheerd met buffers met hoog zout, niet-ionogene detergenten, hoge sacharose, zoals Ionische detergentia en tenslotte chaotropes ureum. 6 , 14 een voor de hand liggende nadeel van dergelijke een sequentiële fractionering protocollen is het flink wat tijd en arbeid inzet nodig om ze te voltooien. Waaronder de homogenisering en ultracentrifugatie, een typische vijf stappen fractionering protocol kan duren uren of zelfs dagen in beslag. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 bovendien zoveel pathologische eiwit-aggregaten blijven onoplosbaar in alle, maar de zwaarste omstandigheden19,20 allermeest naar de gegenereerde breuken zijn van beperkte waarde. De minder strenge fractionering stappen met behulp van hoge concentraties van zout en niet-ionogene wasmiddelen zijn dus grotendeels overbodig.
Eerdere studies hebben aangetoond dat de Ionische detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) een uitstekende kandidaat is voor een vereenvoudigde-voor-stapmodus wasmiddel fractionering protocol is. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als een denatureren wasmiddel, sarkosyl is streng genoeg zijn om de overgrote meerderheid van native gevouwen eiwitten in de hersenen solubilize zonder solubilizing misfolded eiwit-aggregaten samengesteld uit bèta-amyloid (Aβ),6,11 gefosforyleerd tau (pTau),6 TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43),14 alpha-synuclein,12,13 scrapie,23 of U1 kleine nucleaire ribonucleoproteins (snRNP’s U1) zoals U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Zoals sarkosyl is minder streng zijn dan de alomtegenwoordige anionogene detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS), behoudt het minder robuust oligomere vormen van misfolded eiwit-aggregaten die SDS behandeling niet kunnen weerstaan. 9
We beschreven eerder, een verkorte wasmiddel-fractionering protocol dat vergelijkbaar met de meer bewerkelijke sequentiële fractionering methodologieën resultaten. 5 door het weglaten van de minder strenge fractionering stappen, we konden een facile-voor-stapmodus fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van postmortem menselijke hersenen ontwikkelen. 5 dit gedetailleerde protocol hierin beschreven is geschikt voor een brede waaier van experimentele toepassingen variërend van het westelijke bevlekken en massa spectrometrie gebaseerde proteomics functioneel eiwit misfolding en aggregatie zaaien testen. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin we introduceren en bespreken van een verkorte-voor-stapmodus wasmiddel-fractionering protocol dat is van toepassing op een breed scala aan experimentele toepassingen variërend van proteomics massa spectrometrie gebaseerde analyse tot functionele eiwit misfolding testen en westelijke bevlekken. 5 , 6 , 7 , 10 deze methodologie is misschien wel de meeste effectieve wanneer gebruikt bij he…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Drs. Jim Lah en Allan Levey, Emory afdeling Neurologie, voor nuttige opmerkingen en suggesties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de versnelde geneeskunde partnerschap grant (U01AG046161-02), the Emory Alzheimer’s Disease Research Center (P50AG025688) en een National Institute on Aging toekennen (R01AG053960-01) N.T.S. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk gesteund door de Neuropathologie kern van de Emory Neuroscience NINDS Core faciliteiten subsidie, P30NS055077.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
Riferimenti
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
