炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング
Summary
血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。
Abstract
内皮層は、多くの異なる機能を制御することによって体内の恒常性を維持するために不可欠です。内皮層による炎症反応の調節は、効率的に有害な入力との戦いや、被災地の回復の援助に不可欠です。Ccl5、Cxcl1、Cxcl10 など水溶性の炎症性サイトカインを表現してトリガー内皮細胞がリポ多糖 (LPS)、グラム陰性の細菌膜の外側のコンポーネントなど、炎症性の環境にさらされる、循環白血球の活性化。さらに、内皮細胞表面に接着分子 E セレクチン、VCAM 1 と icam-1 の発現は相互作用および内皮層と最終的に炎症を起こしている組織へ漏出する活性化白血球接着できます。このシナリオで、過剰なまたは欠陥のある活性化白血球動員は炎症関連疾患につながる可能性がため血管内皮機能はしっかりと調整されなければなりません。これらの疾患の多くは効果的な治療法はありません、ので血管の層を中心に新しい戦略を調べる必要があります。白血球機能を変更新規の内皮レギュレータの検索に有用な包括的な試金を提案します。含むいくつかのテクニック (など、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子) 白血球動員に関与する特定の表現ターゲットを用いた内皮活性化分析: リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR)、西部のしみ方、フローサイトメトリーおよび接着アッセイの流れ。これらのアプローチは、炎症における血管内皮機能を決定して新しい治療戦略の設計の潜在的価値のある小説の内皮炎症性の規制当局を特徴付けるためのスクリーニングアッセイを実行する非常に便利です。
Introduction
炎症が感染性病原体、病原体を排除し、損傷した組織を修復する主要な目的に対して有益な生物学的反応です。炎症は慢性感染症や自己免疫疾患など、特定の条件下では解決しません。代わりに、連続浸潤白血球、組織の損傷、線維化、損失関数、および全体的な障害者と患者のいくつかの例の死につながる長期免疫応答の結果の異常な反応があります。これらの人間の疾患、炎症性疾患としてカタログ化すべては白血球の血管外漏出1,2の制御のための血管を含みます。
血管内皮細胞は、白血球が人身売買を制御することによって炎症反応の調節に基本的な役割を果たします。安静時の内皮をアクティブにし、炎症性サイトカイン(Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1 等)と接着分子 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 表現内皮層が LPS など炎症性メディエーターにさらされて、その好意感染部位に白血球の循環の募集。リリースされたサイトカインによってプライミング白血球ローリングと特派員の接着対応による内皮層との相互作用を仲介する: セレクチン VCAM 1 α4β1 インテグリン、icam-1 へ αLβ2 インテグリン PSGL 1。最後に、白血球は炎症3の焦点に向かって血管間で移行します。
炎症性応答の調節における血管内皮細胞の重要な役割は、LPS 受容体、toll 様受容体 4 (TLR4) 内皮細胞でのみ表現する遺伝的に変更されたマウスで実証されています。これら内皮 TLR4 の動物が lps の炎症と菌接種後に生成される感染症を検出する対応し、その結果感染解像度と野生型マウス4と同等のレベルで生存を達成することができます。,5。
炎症性応答の内皮規制経路のためと仮定されている白血球の血管内皮細胞の相互作用のいくつかの段階で抑制が内皮の移行とのより良い予後の削減になること炎症関連疾患。実際には、炎症性疾患6、7のための治療として免疫細胞の血管外漏出を妨げるため内皮細胞活性化と白血球の血管内皮細胞の相互作用を対象とするいくつかの戦略を設計されています。
本報告では、炎症性刺激の lps 応答の内皮の活動と白血球の活性化と血管の層への接着におけるその役割を完全に特徴づける培養技術の徹底したグループを表します。Hortelano et al.による記述で、この原稿で使用される内皮細胞モデルはマウス肺血管内皮細胞ライン (MLEC-04)8.、MLEC 04 セルラインは内皮活性化9,10を勉強する適切なシステムであるため文献で検証されています。研究に基づいて、これらのアプローチが容易に推定する、血管内皮に白血球のシステムや炎症性プロファイル。選択した条件で血管内皮のパラメーターを定義した後、システムは血管の活性化を評価する提案の実験に新薬をテストできます。炎症性の中で、セルの条件を制御する目的の化合物をテストする内皮細胞を比較できます、任意の結果の違いは薬の開発と炎症の進行に予後の結果を通知可能性があります。最後に、血管内皮細胞炎症関連疾患に対する新規血管特定薬剤の設計に影響を与える新しい創薬ターゲットの特性に関連するシステムを提案する.
Protocol
Representative Results
Discussion
この内皮細胞のプロトコルでは、炎症反応の調節に関与する探索機構のための基礎を確立する段階的な技術について説明します。これらのアプローチ LPS 刺激血管内皮の活動の研究に基づいており、具体的には炎症性応答の間に白血球動員に関与する重要なステップの評価: 内皮細胞のサイトカインのリリースでは、内皮細胞の接着血管層に分子式と白血球接着。内皮のパラメーターを確立す…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事に支えられた Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO)、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III (ISCIII) (許可番号 IERPY 1149/16 アダムローリー; にMPY 1410/09 s. Hortelano に);で、フォンド ・ デ ・危惧サラッド (FIS) (S. Hortelano に番号 PI11.0036 および PI14.0055 を付与) を介して MINECO。S. エランス ・ ISCIII から IERPY 1149/16 に対応しました。
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
Riferimenti
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
