تكييف قنبلة ذبابة الفاكهة كتدبير للتعلم والذاكرة
Summary
يصف هذا البروتوكول التعلم ذبابة الفاكهة والذاكرة فحص يسمى تكييف التوافه. ويستند هذا الفحص الكلاسيكي على الحد من سلوك المغازلة الذكور بعد الرفض الجنسي من قبل الإناث غير تقبل فرضية. هذا الشكل الطبيعي من اللدونة السلوكية يمكن استخدامها لاختبار التعلم، والذاكرة على المدى القصير، والذاكرة على المدى الطويل.
Abstract
وقد تم توضيح العديد من الأفكار في الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم والذاكرة من خلال استخدام المقايسات السلوكية البسيطة في الكائنات نموذج مثل ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر . ذبابة الفاكهة مفيد لفهم علم الأعصاب الأساسي الكامن وراء العجز المعرفي الناجم عن الطفرات في الجينات المرتبطة بالاضطرابات المعرفية البشرية، مثل الإعاقة الذهنية (إد) والتوحد. يصف هذا العمل منهجية لاختبار التعلم والذاكرة باستخدام النموذج الكلاسيكي في ذبابة الفاكهة المعروفة باسم تكييف التودد. الذكور الذباب الإناث المحكمة باستخدام نمط متميز من السلوكيات التعرف عليها بسهولة. الإناث في مرحلة ما قبل الولادة ليست مستعدة للتزاوج وسوف ترفض محاولات الانتصاب الذكور. وردا على هذا الرفض، تقلل ذباب الذكور من سلوكهم في التودد. ويقاس هذا الحد من التعلم في السلوك المغازلة مع مرور الوقت، بمثابة مؤشر للتعلم والذاكرة. النوم الأساسيالناتج ريكال من هذا الفحص هو مؤشر التوازي (سي)، الذي يعرف بأنه النسبة المئوية من الوقت أن الذكور تنفق المغازلة خلال 10 دقيقة الفاصل الزمني. مؤشر التعلم (لي) هو الانخفاض النسبي لل سي في الذباب التي تعرضت إلى الإناث المفترسة مقارنة مع الذباب السذاجة مع أي لقاءات الاجتماعية السابقة. للمقارنة الإحصائية بين ليس بين الأنماط الجينية، يتم استخدام اختبار العشوائية مع بوتسترابينغ. لتوضيح كيف يمكن استخدام مقايسة لمعالجة دور الجينات المتعلقة بالتعلم والذاكرة، وتميز ضربة قاضية عصبية عموم من ديهيدروكسياسيتون فوسفات أسيلترانزفيراس ( داب في ) هنا. و أورثولوغ الإنسان من داب في ، غليسيرونيفوسفهات O- أسيلترانزفيراس ( غبت )، وتشارك في غضروفي تنسج غضروفي نوع بونكتاتا 2، متلازمة جسمية المتنحية التي تتميز إد الشديد. باستخدام مقايسة تكييف التهوية، فقد تقرر أن داب في في مطلوب للذاكرة طويلة الأجل، ولكن ليس لذاكرة قصيرة المدي. هذه النتيجة بمثابة أساس لمزيد من التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة.
Introduction
يتم حفظ الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم والذاكرة في كثير من الأنواع. وقد وفر العمل الرائد فحص خطوط ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر للعيوب في التعلم الشم والذاكرة رؤى الجزيئية الرئيسية في العمليات الكامنة وراء التعلم والذاكرة 1 . حددت هذه الدراسات بعض الجينات الأولى المشاركة في التعلم والذاكرة، مثل روتاباغا 2 ، أمنيزياك 3 ، و دونس 4 ، وكشف عن دور حاسم لإشارات الأدينوسين أحادي الفوسفات (كامب) 5 .
تم إجراء الشاشات الوراثية في وقت مبكر لمسوخ الذاكرة في المقام الأول باستخدام تكييف الشم. ومع ذلك، ظهرت عدة طرق لقياس أشكال أخرى من التعلم والذاكرة مع مرور الوقت. واحدة من نماذج التعلم والذاكرة الأكثر استخداما، والمقايسة الموصوفة هنا، ويعرف باسم جتكييف الهواء، والتي وصفت لأول مرة من قبل سيجل والقاعة 6 ، ثم تم صقله لاحقا من قبل عدة مجموعات بحثية أخرى 7 ، 8 ، 9 . ويتوقف تكييف الكراهية على وجود فرمون محدد، خلات الفيسينيل (كفا)، على بطن الإناث، الذي يودعه الذكور أثناء الجماع. استشعار سفا على بطن الإناث يقلل بشكل طبيعي من سلوك المغازلة، وعندما يقترن مع فعل الرفض من قبل الإناث، وتأثير سفا على الحد من الذكور الانخراط في تعزيز كبير. استجابة الذباب الذئاب في هذا الفحص يمكن قياسها بسهولة من خلال مراقبة سلوكها التهام مميزة، والتي تتميز بالتوجه نحو وبعد الإناث، والتنصت، وتمديد وتهتز الجناح والعق، ومحاولة الجماع 10 ( الشكل 1A ). الذباب الذكور تعلم ديستنغويس (ح) بين الإناث المتقلبات البكر وغير المستقبلة 11 ، وبعد الرفض الجنسي، فإنها تعرض سلوك التودد أقل تجاه الإناث غير المستقبلة لمدة تصل إلى 9 أيام 8 . ويمكن استخدام هذا السلوك الطبيعي لتوضيح الآليات الكامنة وراء التعلم، الذاكرة على المدى القصير (ستم)، والذاكرة على المدى الطويل (لتم) 8 ، 9 ، 12 . ويعرف التعلم بأنه التخفيض الفوري في سلوك المغازلة التي تحدث خلال فترة التدريب وغالبا ما يشار إليها باسم الذاكرة استدعاء فورية، وقياس 0 – 30 دقيقة بعد التعرض للإناث متزاوج 6 ، 8 . يتم قياس ستم بين 30 دقيقة و 1 ساعة بعد التدريب، في حين يتم قياس لتم في معظم الأحيان 24 ساعة بعد التدريب 8 ( الشكل 1B ). ستم يمكن أن يسببها باستخدام فترة التدريب 1-ساعة، لكنه يستمر فقط لمدة 2-3 ساعةs = "كريف"> 6 ، 8 . في معظم نماذج التعلم، يمكن أن يتم تحفيز لتم فقط من نوبات متباعدة من التدريب المتكرر. مكبريد وآخرون . (1999) 8 أن ثلاث دورات تدريبية متباعدة، لمدة ساعة واحدة كانت كافية للحث على ذاكرة المغازلة لمدة تصل إلى 9 أيام، على النقيض من 2-3 ساعة الناجم عن دورة تدريبية واحدة ساعة واحدة. ماكبرايد وآخرون . 8 أيضا أن دورة تدريبية واحدة لمدة 5 ساعات تنتج استجابة لتم مماثلة لمدة تصل إلى 9 أيام. الذباب لا المحاكم باستمرار خلال هذه الفترة 5-ساعة، في الواقع إنتاج التدريب الخاصة بهم متباعدة للحث على لم في دورة تدريبية واحدة. هذا مهم جدا من منظور عملي، زيادة كبيرة في سهولة التي يمكن أن تستخدم هذه المقايسة للتحقيق لتم. البروتوكولات الحالية تستخدم في الغالب دورة تدريبية واحدة من 7 ساعة ل لتم 11 ، 12 . وقد بحثت عدة دراسات مختلفةوالظروف الطافرة التي لها عيوب محددة في جوانب مختلفة من التعلم التعارف. على سبيل المثال، يؤثر الفطر الجسم الاجتثاث ستم و لتم، ولكن لا تعلم 8 . الطفرات في الجين أمنيزياك، الذي تم تعريفه أولا كمنظم محدد للذاكرة باستخدام تكييف الشم، 3 ، تؤثر على ستم ولكن لا تعلم 6 . تعطيل منظم الترجمة orb2 (oo18 رنا ملزمة (أورب) CPEB2 فصيلة فرعية وإشارات إديسون تؤثر حصرا لتم 9 ، 13 . وهكذا، فإن تكييف التمارين هو نموذج مفيد لتشريح الآليات الكامنة وراء مختلف مراحل التعلم والذاكرة.
هذا العمل يدل على الإعداد التجريبي الأمثل الذي يسمح للاختبار عالية الإنتاجية نسبيا من تكييف التودد. وعلاوة على ذلك، فإنه يصف سيناريو التحليل الإحصائي ويناقش العوامل الحاسمة للمقايسة. هو شالخاصة هنا أن الجين ذبابة الفاكهة ديهيدروكاسيتون الفوسفات أسيلترانزفيراس ( داب في ) هو مطلوب في الخلايا العصبية ل لتم، ولكن ليس ل ستم. يتم تحور أورثولوغ الإنسان من هذا الجين، غليسيرونيفوسفهات O- أسيلترانزفيراس ( غنبات )، في غضروفي تنسج غضروفي بونكتاتا نوع 2 14 ، واضطراب جسمية المتنحية التي تتميز الإعاقة الفكرية الشديدة، والمضبوطات، والعديد من الخصائص السريرية الأخرى 15 . في هذا السياق، يمكن استخدام تكييف التورط في التحقق وظيفيا من دور الجينات المرضية البشرية في التعلم والذاكرة، وتوفير أساس للدراسات الميكانيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة مقايسة تكييف هو نموذج كلاسيكي لتحليل التعلم والذاكرة في ذبابة الفاكهة . بروتوكول المقدمة هنا يتبع المنهجية العامة المذكورة سابقا 6 ، 7 ، 8 ، 9 ولكن يشمل جوانب فريدة من نوعها مثل المبادئ التوجيهية العملية، والمعدات المتخصصة، وتحليل البيانات النصي 9 ، 12 لاختبارات العشوائية. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لتحليل أعداد كبيرة من الذباب في موازاة استخدام كتل 96-مسطحة مسطحة القاع ( الشكل 2A ) لجمع وتدريب الذكور. كتل مختومة مع ير فيلم لاصق، مما يجعل الذباب يمكن الوصول إليها بسهولة عند الحاجة. بالإضافة إلى ذلك، فإن غرف التهذيب فريدة من نوعها وصف هنا تسمح للاقتران في وقت واحد من 18 زوجا من الذكور والإناث في مساحة ما يقرب من ثنائي الأبعاد أناالأمثل لتحليل الفيديو. غرف التزيين مصممة خصيصا سهلة الاستخدام، وتقدم خطة بناء ( ملف S1 ، الشكل 2D ). هذا البروتوكول، من إنشاء الثقافات المستخدمة لجمع المواضيع اختبار لاقتناء بيانات الفيديو، يستغرق حوالي 20 يوما ( الجدول 1 ). مطلوب وقت إضافي لتحليل بيانات الفيديو. في تجربتنا، و ستم مقايسة قوية للغاية. اختبار لتم هو أيضا قوية جدا، ولكن أكثر حساسية لمتغيرات البيئة مربكة، وبالتالي يمكن أن يكون أكثر صعوبة لإتقان.
سلوك الحيوان يمكن أن يكون متغير جدا. لذلك، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة في البروتوكول مع الحرص على تقليل هذا التباين. أولا، استخدام لطيف من الشافطة ( الشكل 2B ) سوف يقلل من الإجهاد التي يمكن فرضها عن طريق التعامل مع الخام أو عن طريق تهب بقوة كبيرة. طريقة مقترحة لنقل الفردالذباب من الشافطة هو باستخدام جيوتاكسيس السلبية. كما الذباب تميل إلى المشي، يمكن للمرء ببساطة تشير غيض من الشافطة تصل؛ فقط قبل ذبابة تصل إلى طرف، ضربة لطيف كافية للسماح للطيران خارج. بالإضافة إلى ذلك، للسماح للذكور في غرف التودد قبل الاختبار، ضربة غالبا ما تكون غير ضرورية.
خطوة هامة أخرى هي جمع وتوليد المواضيع اختبار الذكور. يجب جمع جميع الذكور عندما تكون صغيرة جدا وساذجة اجتماعيا. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق جمع المتكرر خلال فترات الذروة من إكلوسيون (الخطوة 5.2). إذا لم يتم جمع الذكور في هذا الإطار الزمني ضيق، فإنها يمكن أن يكون التفاعلات الاجتماعية في وقت مبكر، مما قد يؤدي إلى ضعف التعلم أو التباين العالي في سي. وثمة عامل آخر من الموضوعات اختبار الذكور التي ينبغي تقييمها هو الخلفية الجينية. سوف تظهر خلفيات وراثية مختلفة مستويات مختلفة من التهاوج الساذجة وقد تختلف أيضا في النشاط العام أو القدرة الحركية. عندما كومبايجب أن تؤخذ الرعاية فيما يتعلق بالخلفية الوراثية من أجل تجنب هذه العوامل المربكة التي قد تؤثر على عشرات لي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تقييم توزيع بيانات سي بعناية. يمكن أن تكون البيانات سي على حد سواء حدودي وغير المعلمي، اعتمادا على النمط الوراثي أو العوامل البيئية الأخرى. وفي بعض الحالات، إذا كان توزيع سي متحيزا بشكل كبير بعيدا عن التوزيع الطبيعي، قد يكون من الأفضل استخدام الوسيط سي بدلا من المتوسط لحساب المعطيات ليس. ومع ذلك، في تجربتنا، واستخدام وسي أو متوسط سي لا تحدث فرقا في التفسير الإحصائي للبيانات، واستخدام متوسط سي هو الممارسة الشائعة في الأدب.
ومن أجل نجاح التهيئة، فإن الرفض النشط لمحاولات الذكور من قبل النساء اللواتي يعانين من اضطرابات أمر بالغ الأهمية خلال فترة التدريب. من المهم التأكد من أن الإناث المفترسة المستخدمة في هذا الفحص قد تزاوجت بكفاءة وهيوبالتالي لا يسمح الجماع. يتم إنشاء هذا الافتراض في قارورة التزاوج أعدت في الخطوة 4، حيث يتم وضع الذباب الذكور والإناث معا لمدة 4 أيام ( الجدول 1 ). وفي وقت لاحق، يمكن رصد التزاوج عن طريق الفحص المنتظم لمقاطع الفيديو اختبار ومراقبة الأزواج الذكور والإناث أثناء التدريب. إذا حدث التزاوج، وهناك العديد من التدابير التي يمكن اتخاذها أثناء إعداد الإناث المخططة. أولا، ينبغي أن تربي الإناث فرضها في ظل ظروف التربية المثلى. يمكن أن تستكمل قوارير مع عجينة الخميرة ورقة مرشح مطوية لزيادة السطوح التزاوج المحتملة. وقد أدت حضانة الذباب في ظل الظروف الموصوفة هنا إلى إناث متقاربة قوية في الماضي، ولكن هذا قد يختلف في مختبرات مختلفة وباستخدام سلالات وراثية مختلفة. لذلك، قد يكون من الضروري لتحسين توليد الإناث من قبل متفاوتة من خلال تغيير وقت الحضانة والشروط.
القياس الكمي لسلوك التودد هوخطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول. ويمكن القيام بذلك يدويا أو تلقائيا باستخدام برامج متخصصة 9 . الكمي الآلي سريع، من حيث المبدأ، غير منحازة. وقد نشرت عدة برامج 21 و 22 و 23 ؛ ومع ذلك، فهي ليست واضحة للاستخدام، وغالبا ما تتطلب صيغ الفيديو المتخصصة والمهارات الحسابية المتقدمة. التكميم اليدوي هو سهل ودقيق، ولكنه كثيف العمالة كثيفة وتخضع للتغيرات الفردية والتحيز. ومن المهم التأكيد على أن هذا البروتوكول لا يعالج متطلبات تنسيق الفيديو التي قد تكون مطلوبة من أجل القياس الكمي الآلي لل سي. للحصول على دليل الكمي، استخدام أي جهاز تسجيل الفيديو بسيطة التي لديها القدرة على إنتاج شريط فيديو من نوعية كافية لمراقبة بدقة السلوك المغازلة. لالكمي الآلي، سيكون هناك على الأرجح مختلفةمتطلبات اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ويجب على المستخدمين التحقيق في هذا بدقة إذا كان المطلوب الكمي الآلي.
في تركيبة مع الأدوات واسعة النطاق المتاحة للتلاعب الجيني من الذباب، ومقايسة تكييف التهذيب يوفر قراءات قوية التي يمكن استخدامها لتشريح الآليات الجزيئية والشبكات العصبية المشاركة في التعلم والذاكرة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف بمركز موارد ذبابة الفاكهة في فيينا لتوفير سلالات ذبابة الفاكهة . بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الأسهم التي تم الحصول عليها من مركز الأوراق المالية بلومينغتون ذبابة الفاكهة (نيه P40OD018537) في هذه الدراسة. وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل شبكة FP7 الاتحاد الأوروبي واسعة النطاق المتكاملة جينكوديس إلى كك، هفب، و أس و نسرك ديسكفري و سيهر المنح المشروع ل جمك
Materials
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | – | – | Any sharp will do |
| Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | – | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – | ||
| Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | – | |
| Corn flour | de Molen | – | |
| Sugar | de Molen | – | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – |
Riferimenti
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
